Questo protocollo può essere utilizzato per ottenere una maggiore comprensione delle dinamiche e dei ruoli delle fosfoproteine attive durante lo sviluppo craniofacciale dei mammiferi. Questo protocollo supera la barriera comune della defosforilazione durante l'isolamento proteico da due contesti fisiologicamente rilevanti, i processi facciali del topo e le cellule mesenchimali palatali embrionali di topo in coltura. È imperativo muoversi rapidamente mantenendo tutti i reagenti e i materiali sul ghiaccio e utilizzare inibitori della fosfatasi in tutti i tamponi di lisi per mantenere l'integrità delle proteine fosforilate.
Per iniziare, posare il corpo del topo su una tavola di dissezione con il lato ventrale rivolto verso l'alto e spruzzare l'addome del topo con il 70% di etanolo. Quindi aprire la cavità addominale pizzicando e sollevando la pelle anteriore all'apertura vaginale con pinze Semken dritte. Successivamente, tagliare la pelle sollevata negli strati sottostanti con forbici chirurgiche a lama dritta con un angolo di 45 gradi su entrambi i lati per generare una forma a V che si estende a ciascuna superficie laterale all'incirca a metà strada tra i quattro arti e gli arti posteriori.
Usando la pinza di Semken, afferrare una delle corna uterine e tagliare sotto l'ovidotto e sopra la cervice con le forbici chirurgiche. Per consentire la completa rimozione del corno uterino, tagliare via il mesometrio, quindi trasferire il corno uterino sezionato a 10 millilitri di PBS istologico in una capsula di Petri di 10 centimetri. Allo stesso modo, rimuovere il secondo corno uterino sul lato opposto della cavità addominale.
Successivamente, posizionare la capsula di Petri di 10 centimetri contenente entrambe le corna uterine sul ghiaccio. Sotto uno stereomicroscopio sezionante, sezionare attentamente ogni embrione dalle corna uterine con Dumont 5 pinze fini. Quindi allontanare lentamente il miometrio, la decidua e il corion.
Quindi, strappare e rimuovere l'amnione relativamente trasparente che circonda l'embrione e recidere il cordone ombelicale che collega l'embrione alla placenta. Quindi trasferire ogni embrione sezionato a 2,5 millilitri di PBS istologico in un pozzetto individuale di una piastra di coltura cellulare a 12 pozzetti su ghiaccio utilizzando un pipetto di trasferimento in plastica tagliato. Preparare tre piastre di Petri da 10 centimetri contenenti 10 millilitri di PBS istologico e tenerle sul ghiaccio per essere utilizzate nella rotazione tra gli embrioni.
Quindi trasferire un embrione da un pozzetto individuale della piastra di coltura cellulare a 12 pozzetti a una delle piastre di Petri da 10 centimetri con PBS istologico su ghiaccio usando una pipetta di trasferimento in plastica tagliata. Sotto il microscopio di dissezione, separare ogni processo mascellare dal viso usando la pinza fine facendo prima un taglio sul lato anteriore di un processo mascellare lungo la rientranza naturale che separa il processo nasale laterale nel processo mascellare. Quindi, tagliare il lato posteriore del processo mascellare lungo la rientranza naturale che separa il processo mascellare e il processo mandibolare.
Quindi separare completamente il processo mascellare effettuando un taglio verticale dai lati anteriore a quello posteriore del processo mascellare sul lato oculare del processo mascellare dove terminano le rientranze naturali di cui sopra. Utilizzando una pipetta Pasteur da nove pollici con un piccolo bulbo di lattice da due millilitri, trasferire la coppia sezionata di processi mascellari in una piccola goccia di circa 30 microlitri di istologia PBS in una capsula di Petri da 35 millimetri etichettata su ghiaccio. Quindi trasferire la coppia di tessuti di processo mascellare in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri etichettato su ghiaccio utilizzando la pipetta Pasteur, riducendo al minimo il trasferimento di PBS istologico.
Inoltre, rimuovere l'eventuale PBS istologico in eccesso nel tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri con la pipetta Pasteur. Aggiungere 0,1 millilitri di tampone di lisi NP40 ghiacciato con inibitori della proteasi e della fosfatasi aggiunti immediatamente prima dell'uso sul ghiaccio. Quindi pipettare su e giù 10 volte con un PIPETMAN da 200 microlitri.
Successivamente, vortice per 10 secondi, quindi pipetta su e giù 10 volte con un PIPETMAN da 200 microlitri, evitando la generazione di bolle. Incubare a quattro gradi Celsius per due ore mentre si ruota end-over-end usando una pagaia da 1,5 millilitri o due millilitri con un revolver a tubo. Quindi centrifugare i campioni a 13.500 x g per 20 minuti a quattro gradi Celsius e raccogliere il surnatante in un nuovo tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri su ghiaccio con un PIPETMAN da 200 millilitri.
In primo luogo, aspirare il mezzo dalle cellule mesenchimiche palatali embrionali di topo utilizzando una pipetta Pasteur da 5,75 pollici collegata a un sistema a vuoto. Quindi lavare le cellule due volte con PBS di coltura di tessuto ghiacciato e inclinare la piastra di lato durante l'ultimo lavaggio per garantire che tutta la coltura tissutale PBS sia aspirata. Quindi, aggiungere il tampone di lisi NP40 ghiacciato con inibitori della proteasi e della fosfatasi aggiunti immediatamente prima dell'uso sul ghiaccio per lisare le cellule.
Incubare la piastra sul ghiaccio per cinque minuti con rotazione circa ogni minuto per garantire una copertura completa della piastra. Quindi raschiare le celle dalla piastra usando un sollevatore di celle pre-raffreddato e trasferire la sospensione cellulare in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri pre-raffreddato su ghiaccio. Successivamente, incubare la sospensione cellulare a quattro gradi Celsius per 30 minuti mentre si ruota end-over-end utilizzando una paletta da 1,5 millilitri o due millilitri con un revolver a tubo.
Quindi centrifugare i campioni a 13.500 x g per 20 minuti a quattro gradi Celsius e raccogliere il surnatante in un nuovo tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri su ghiaccio con un PIPETMAN da 200 millilitri. L'analisi Western blot di lisati di cellule intere da cellule mesenchimali palatali embrionali di topo immortalizzate dopo stimolazione con ligando PDFG-B da 2 a 15 minuti ha rivelato bande riproducibili distinte per le fosfoproteine che corrono all'altezza o vicino all'altezza della corrispondente banda proteica totale. Un aumento delle intensità della banda di fosfoproteine è stato osservato dopo il trattamento con un fattore di crescita rispetto a quelli delle cellule non trattate, mentre le intensità totali della banda proteica erano relativamente uguali tra i campioni.
Questo protocollo può essere utilizzato per sondare come le perturbazioni e la fosforilazione influenzano direttamente la segnalazione intercellulare, l'espressione genica e l'attività cellulare in contesti craniofacciali.
