Questo metodo è dedicato allo studio del ruolo dei microtubuli durante l'invasione del cancro al cervello accoppiando l'iniezione atopica di cellule tumorali cerebrali nel pesce zebra all'imaging intravitale subcellulare. Il principale vantaggio della tecnica risiede nell'elevata risoluzione temporale spaziale alla quale viene acquisito il citoscheletro dei microtubuli. È unico per i modelli di invasione del cancro cerebrale in vivo e consente un'analisi approfondita della dinamica dei microtubuli.
L'imaging subcellulare dell'invasione delle cellule tumorali cerebrali in situ può essere utilizzato per l'analisi di qualsiasi proteina di interesse potenzialmente coinvolta nell'invasione del cancro. Per iniziare, lavare le cellule di glioblastoma coltivate a 37 gradi Celsius con PBS. Staccare le cellule aggiungendo un millilitro di 0,05% di tripsina EDTA e incubare per cinque a 10 minuti a 37 gradi Celsius nell'incubatore cellulare fino a quando tutte le cellule sono completamente staccate.
Risospendere le cellule in cinque millilitri di mezzo cellulare completo di glioblastoma in una provetta da centrifuga da 50 millilitri. Aggiungere 45 millilitri di PBS ghiacciato e centrifugare a 134 volte G per cinque minuti. Scartare il surnatante e risospendere le cellule con un millilitro di PBS ghiacciato pipettando su e giù accuratamente.
Aggiungere altri 49 millilitri di PBS ghiacciato e centrifugare a 134 volte G per cinque minuti. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 200 microlitri di PBS ghiacciato. Conservare su ghiaccio per tutta la durata della procedura di trapianto.
Per microiniettare le cellule di glioblastoma nel mesencefalo delle larve di zebrafish, riempire una piastra di microiniezione con sei millilitri di terreno E3 integrato con 160 milligrammi per litro di tricaina. Trasferire una dozzina di larve di DEE-KOHR-EE-UH-NAY-TED nella piastra di microiniezione. Una volta che le larve sono anestetizzate, e completamente insensibili al tatto, allineatele nelle trincee su un fianco, testa in su e il sacco vitellino spinto contro il muro della trincea con un pennello di taglia 00.
Quindi caricare cinque microlitri di cellule di glioblastoma nel micro capillare utilizzando punte di microcaricamento e inserire il capillare nel supporto capillare universale. Posizionare la piastra di microiniezione contenente le larve anestetizzate sul palco del microscopio stereo. Posizionare la punta del micro-capillare sul bordo della piastra di microiniezione utilizzando le manopole del micromanipolatore.
Quindi romperlo con un bisturi per creare un punto di ingresso affilato delle dimensioni del diametro di una cella. Verificare che le cellule stiano fuoriuscendo dal capillare facendo scorrere delicatamente l'olio nel microiniettore e immergendo la punta dell'ago nel mezzo. Concentrare le cellule sulla punta del capillare per massimizzare il numero di cellule iniettate per volume iniettato ed evitare di riempire il tessuto cerebrale con PBS.
Esaminare attentamente le cellule che escono dal micro capillare mentre l'olio viene introdotto manualmente nell'iniettore. Definire empiricamente il numero di giri necessari sulla manopola manuale per fornire da 20 a 50 celle. In genere, se le cellule sono abbastanza concentrate, è sufficiente un giro delicato per espellere circa 10 cellule.
Avvicina la punta del capillare contro il tectum ottico sinistro appena sopra la vena cerebrale media. Premere delicatamente il capillare contro le larve fino a quando la membrana cutanea si rompe. Una volta raggiunta una posizione adatta nel tectum ottico, espellere le cellule.
Osservare attentamente la punta del capillare per visualizzare il flusso di cellule che entrano all'interno dell'animale, garantendo così un'iniezione di successo. Ripetere la procedura per tutti gli animali necessari. A seconda della velocità con cui lo sperimentatore è in fase di iniezione, potrebbe essere necessario un cambio di ago ogni 10-20 larve a causa del rapido aggregazione delle cellule nel capillare.
Una volta completato il trapianto di xeno, rimuovere la larva dalla piastra di microiniezione e individuarla in una piastra da 24 pozzetti riempita con acqua minerale PTU e terreno blu di metilene. Preparare una soluzione AH-KROH a basso punto di fusione all'1%. Trasferire 500 microlitri di soluzione bollita di AH-KROH all'1% a basso punto di fusione in un tubo da centrifuga da 1,5 millilitri e lasciarlo raffreddare a 37 gradi Celsius su un blocco termico.
aggiungere 160 microgrammi per litro di tricaina all'AH-KROHS e mescolare bene. Trasferire da una a quattro larve xenotrapiantate in una capsula di Petri di 3,5 centimetri riempita con acqua minerale PTU e terreno di metilene integrata con 160 microgrammi per litro di tricaina. Una volta che le larve sono anestetizzate e completamente insensibili al tatto, trasferirle con cura nel tubo contenente AH-KROHS e tricaina usando una pipetta di trasferimento a punta fine.
Mescolare delicatamente la larva con AH-KROHS. Utilizzando una grande pipetta di trasferimento del bulbo, posizionare le larve mescolate nell'AH-KROHS al centro di una parabola di imaging video con fondo di vetro da 3,5 centimetri Sotto un microscopio stereoscopico posizionare rapidamente le larve sul dorso. Utilizzando una punta di micro caricamento, rimuovere AH-KROHS extra per mantenere lo strato AH-KROHS più sottile possibile.
Una volta che AH-KROHS si è solidificato, aggiungere 2,5 millilitri di supporto di imaging. Per l'imaging live in vivo, della dinamica dei microtubuli nelle cellule di glioblastoma invasori, posizionare la parabola di imaging video contenente le larve xenotrapiantate incorporate AH-KROHS nella camera ambientale di un microscopio confocale invertito con una temperatura impostata a 32 gradi Celsius. Trova le larve nella parabola di imaging video con un obiettivo 10x utilizzando uno stadio XY motorizzato.
Premere Esc per abbassare la torretta degli obiettivi e aggiungere olio minerale su un obiettivo 60x dell'olio, quindi premere Esc per tornare alla posizione focale iniziale. Osservare le cellule di glioblastoma invasori nel canale rosso impostato su una sorgente laser a 561 nanometri, potenza laser del 20% e un'esposizione temporale di 200 millisecondi. Quindi selezionare una cella con una rete di microtubuli diffusa e filamenti di microtubuli facilmente distinguibili.
Impostare le impostazioni della serie Z. Utilizzando uno stadio piezoelettrico di 200 micrometri, selezionare le posizioni superiore e inferiore della rete di microtubuli in cui è sufficiente uno stack Z profondo da 10 a 30 micrometri per visualizzare la rete microbica nella sporgenza della cellula migrante con un passo di fetta Z di 0,3 micrometri. Imposta le impostazioni di acquisizione time lapse per consentire un equilibrio ottimale tra velocità di acquisizione, profondità Z-stack e segnale fluorescente per evitare un rapido sbiancamento delle foto.
Acquisisci immagini dei microtubuli ogni cinque-10 secondi per diversi minuti e salva l'hyper-stack 5D. La dinamica dei microtubuli è stata misurata costruendo un cimografo lungo i microtubuli in crescita e in contrazione e tracciando manualmente i singoli bordi dei microtubuli nel tempo. Il trattamento farmacologico somministrato nel terreno larvale e il suo effetto reversibile sull'organizzazione della rete di microtubuli è stato valutato trattando con una dose di 200 nanomolari di nocodazolo.
Ciò ha portato al progressivo restringimento della rete di microtubuli e alla scomparsa della protrusione delle cellule di glioblastoma dopo quattro ore. Il lavaggio del farmaco ha ripristinato la capacità delle cellule di glioblastoma di formare sporgenze. Le cellule hanno ripreso a migrare lungo la vascolarizzazione 12 ore dopo il washout, indicando che un dosaggio di 200 nanomole di nocodazolo era sufficiente per interrompere la rete di microtubuli e bloccare rapidamente l'invasione delle cellule di glioblastoma in vivo.
Un'analisi di tre giorni dello stesso trattamento sull'invasione globale delle cellule di glioblastoma ha rivelato che il nocodazolo ha fermato l'invasione delle cellule di glioblastoma a lungo termine in vivo senza influire sulla salute generale del pesce rispetto a un controllo. Ricorda di iniziare con larve sane tre giorni dopo la fecondazione per concentrare le cellule nel capillare, per ridurre al minimo il volume iniettato nel cervello e per formare una massa tumorale unica e cercare di evitare l'iniezione nei ventricoli cerebrali.
