Il nostro protocollo per l'isolamento del mesenchima intestinale si traduce in un'alta resa di telociti. Questo metodo offre una piattaforma iniziale per studiare l'interazione cellula-cellula che coinvolge i telocytes nell'omeostasi e nella malattia. I telociti sono cellule uniche sensibili ai protocolli di dissociazione tissutale disponibili.
Pertanto, il principale vantaggio di questa tecnica è l'isolamento del mesenchima, compresi i telociti vitali arricchiti. Il mesenchima, incluso il telocita, può servire come fonte per le molecole di segnalazione e i fattori di crescita necessari per la crescita organizzata ex vivo. Per iniziare, lavare l'intestino, separato da un topo eutanasiato, in una capsula di Petri contenente PBS freddo e sterile.
Metti l'intestino in una capsula di Petri. E usando le forbici a sfera, apri il tubo intestinale longitudinalmente e lava le feci. Trasferire l'intestino in un nuovo piatto contenente PBS fresco e freddo.
Dopo aver lavato l'intestino ancora una volta, tagliare l'intestino tenue in segmenti lunghi un centimetro e trasferirli in un tubo conico da 15 millilitri riempito con otto millilitri di PBS. Agitare il tubo manualmente a uno o due cicli al secondo per un minuto. Versare la soluzione in una capsula di Petri.
E usando una pinza, trasferire il segmento in un tubo conico da 50 millilitri riempito con 20 millilitri di soluzione A.Posizionare i tubi in un incubatore orbitale a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Dopo l'incubazione, agitare vigorosamente il tubo a mano a quattro o cinque cicli al secondo per un minuto per dissociare l'epitelio. Ripetere questo passaggio ancora una volta.
Dopo aver tagliato e lavato i frammenti come dimostrato in precedenza, trasferirli in un nuovo tubo da 50 millilitri riempito con 10 millilitri di PBS sterile e invertire il tubo a uno o due cicli al secondo per un minuto. Versare la soluzione in una capsula di Petri. Trasferire i segmenti in un nuovo tubo da 15 millilitri riempito con 10 millilitri di PBS sterile e inclinare delicatamente su e giù a uno o due cicli al secondo per due minuti.
Sotto un armadio di biosicurezza, utilizzare una pinza per posizionare i segmenti su una salvietta da laboratorio sterile per asciugarli. Una volta asciugati, tagliare ulteriormente gli spicchi a pezzi. Trasferire i pezzi tagliati usando una pinza in una piastra a sei pozzetti riempita con quattro millilitri di soluzione di digestione preriscaldata per pozzetto.
Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 50 minuti e agitare delicatamente la piastra manualmente ogni 20 minuti. Quindi, trasferire i pezzi utilizzando una pipetta Pasteur in un tubo conico da 15 millilitri riempito con quattro millilitri di DMEM. Agitare il tubo manualmente a quattro o cinque cicli al secondo per un minuto per ottenere una sospensione a cella singola.
Filtrare la sospensione attraverso un filtro da 100 micrometri in un tubo conico da 50 millilitri. Centrifugare il filtrato a 700 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il surnatante mediante aspirazione e risospendere il pellet cellulare in cinque millilitri di 2% FBS / PBS.
Dopo aver centrifugato la sospensione ancora una volta a 700 g per cinque minuti, scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 12 millilitri di terreno di coltura. Infine, seminare la sospensione cellulare in piastre a sei pozzetti. Dopo la dissociazione del mesenchima, i telociti perdono le loro caratteristiche cellulari, mostrando una morfologia cellulare rotonda, e riflettono meno cellule GFP-positive il primo giorno rispetto ai giorni successivi.
Pochi giorni dopo, i telocytes mostrano una morfologia cellulare piccola e allungata con processi cellulari brevi. Dopo sette-10 giorni di semina, i telocytes riacquistano le loro caratteristiche cellulari, mostrando una morfologia cellulare ampia e allungata con lunghi processi citoplasmatici. La citometria a flusso rivela la composizione cellulare.
Nel complesso, il 69% delle cellule isolate era vitale sulla base della colorazione DAPI. E di questi, il 60,9% rappresentava la contaminazione epiteliale e le cellule immunitarie ed endoteliali. La frazione telocitaria si è diffusa sopra 100k e 70k FSC e SSC, rispettivamente, e rappresentava quasi il 10% del mesenchima gated.
L'analisi FACS ha rivelato che il sottogruppo di telociti può essere definito mediante colorazione positiva a CD201 e GP38. L'immunocolorazione del mesenchima coltivato di un giorno utilizzando questi marcatori ha mostrato l'espressione di questi marcatori molecolari, nonostante le cellule non presentino le loro caratteristiche cellulari. Questa procedura si traduce in una sospensione monocellulare praticabile di cellule stromali, che può essere utilizzata non solo per la coltura 2D ma per qualsiasi altra applicazione, come la co-coltura 3D con organoidi o bioprinting.
