Questo protocollo descrive una tecnica di piattaforma per isolare le cellule endoteliali microvascolari dai muscoli scheletrici. Queste cellule possono essere utilizzate, ad esempio, per ottenere ulteriori informazioni sulle funzioni della barriera muscolare del sangue. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che è possibile isolare le cellule endoteliali microvascolari primarie con elevata purezza.
Questa tecnica può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle malattie muscolari immuno-mediate come l'interazione tra cellule muscolari ed endoteliali in salute e malattie. In primo luogo, preparare tutte le soluzioni necessarie e le piastre a sei pozzi come descritto nel protocollo. Per iniziare la procedura pratica, ottenere un paio di forbici chirurgiche affilate / smussate, un paio di forbici chirurgiche affilate / affilate e forcette dritte e curve.
Disinfettare tutti gli strumenti chirurgici con il 70% di etanolo. Posizionare un topo maschio adulto eutanasiato sulla schiena e inumidire le gambe con il 70% di etanolo. Utilizzando le forbici chirurgiche affilate / smussate, tagliare ogni gamba intera tagliando l'articolazione dell'anca.
Posizionare le estremità in un piatto di coltura a celle chiuse. Trasferire il piatto in una cappa sterile a flusso laminare. Usa forbici affilate e forcep curve per tagliare la pelle aperta dall'anca alla punta del dito del piedino.
Utilizzare le forcep dritte per tenere la dita dei piedi o il pedante mentre si utilizzano le forcep curve per staccare la pelle dalla dita dei piedi all'anca. Per isolare il quadricipite muscoloso femoris, tagliare il tendine dal ginocchio e tagliare il muscolo lungo il femore all'anca. Sever il tendine d'Achille per isolare i tricipiti muscolati surae.
Quindi, tagliare lungo la tibia alla fossa poplitea e rimuovere il muscolo. Per rimuovere i tendini che non possono essere dissociati, tenere i muscoli con le forcep curve e tagliare ogni tendine appropriato. Aggiungere 2.445 microlitri di soluzione di digestione preparata a un piatto di coltura cellulare fresco ed etichettato e determinare il peso.
Trasferisci tutti i pezzi muscolari in questo piatto. Quindi, determinare il peso. La differenza di entrambi i valori misurati fornisce il peso secco del tessuto muscolare che non deve superare un grammo.
Usando le forbici affilate chirurgiche, tagliare l'intero tessuto muscolare a piccoli pezzi. Incubare la sospensione tissutale a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% per 1,5 ore, assicurandosi di mescolare attentamente la sospensione con una siringa per insulina da un millilitro ogni 20 minuti per circa cinque minuti. Dopo l'incubazione, trasferire la sospensione su un colino in nylon da 70 micrometri posto su un tubo etichettato da 50 millilitri e raccogliere il flusso attraverso.
Lavare il filtro cellulare con otto millilitri di DMEM e raccogliere il flusso attraverso. Se i pezzi stanno collegando il filtro, rimorsi la soluzione dissociata. Scartare il filtro cellulare e centrifugare la sospensione a 300 volte la gravità e a 20 gradi Celsius per 10 minuti.
Rimuovere con cura il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in un millilitro di un tampone di llysing di potassio al cloruro di ammonio per lalisi dei globuli rossi. Incubare a temperatura ambiente per 30 secondi. Quindi, aggiungere nove millilitri di DMEM contenenti 10%FCS per interrompere la reazione.
Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 millilitri. Quindi, usa una camera di conteggio delle celle Neubauer per determinare i numeri cellulari. Per iniziare a esaurire le cellule positive del CD45, centrifugare la sospensione a 300 volte la gravità e a quattro gradi Celsius per 10 minuti.
Rimuovere completamente il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in 90 microlitri di tampone MCS. Aggiungere 10 microlitri di microperline CD45 e mescolare le sospensioni. Incubare in frigorifero a quattro-otto gradi Celsius per 15 minuti.
Successivamente, aggiungere un millilitro di buffer MCS. Centrifuga a 300 volte la gravità e a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Rimuovere completamente il supernatante e rimescolare le cellule in 500 microlitri di tampone MCS.
Posizionare una grande colonna magnetica nel campo magnetico del separatore. Risciacquare il serbatoio della colonna con tre millilitri di tampone MCS. Quindi, posizionare un tubo conico da 15 millilitri sotto la colonna per raccogliere il flusso attraverso.
Applicare l'intera sospensione cellulare sulla colonna e lasciarla scorrere completamente. Lavare la colonna tre volte aggiungendo tre millilitri di tampone MCS nel serbatoio per ogni fase di lavaggio e aspettando che il serbatoio della colonna sia vuoto prima di iniziare la fase di lavaggio successiva. Raccogliere le celle senza etichetta che passano attraverso la colonna per utilizzarle in ulteriori passaggi di separazione.
Per iniziare ad accumulare cellule cd31-positive, usate una camera di conteggio delle celle Neubauer per determinare i numeri cellulari. Successivamente, centrifugare le cellule non etichettate a 300 volte la gravità e a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Rimuovere completamente il supernatante e rimescolare il pellet in 90 microlitri di tampone MCS.
Aggiungere 10 microlitri di microperline CD31 e mescolare l'intera sospensione. Incubare in frigorifero a quattro-otto gradi Celsius per 15 minuti. Successivamente, aggiungere un millilitro di tampone MCS e centrifuga a 300 volte la gravità e a quattro gradi Celsius per 10 minuti.
Rimuovere il supernatante e rimescolare le cellule in 500 microlitri di tampone MCS. Posizionare la colonna magnetica media nel campo magnetico del separatore. Risciacquare la colonna con 500 microlitri di tampone MCS.
Quindi, posizionare un tubo conico da 15 millilitri sotto la colonna per raccogliere il flusso attraverso. Applicare l'intera sospensione cellulare sulla colonna e lasciarla scorrere completamente. Lavare la colonna tre volte aggiungendo 500 microlitri di tampone MCS nel serbatoio per ogni fase di lavaggio e attendere che il serbatoio della colonna sia vuoto prima di iniziare la fase di lavaggio successiva.
Le celle senza etichetta che passano la colonna rappresentano la frazione CD45-negativa, CD31-negativa. Conservali per ulteriori controlli di qualità. Quindi, rimuovere la colonna dal separatore e posizionarla su un tubo di raccolta adatto.
Pipettare due millilitri di buffer MCS sulla colonna. Spingere immediatamente lo stantuffo nella colonna per sciacquare le celle con etichetta magnetica. Questa frazione CD45-negativa, CD31-positiva rappresenta gli EC murini primari arricchiti.
Centrifugare la sospensione cellulare a 350 volte la gravità e a 20 gradi Celsius per cinque minuti. Rimuovere completamente il supernatante e rimescolare le cellule in un millilitro di mezzo cellulare endoteliale. Trasferire le cellule in un singolo pozzo di una piastra di coltura rivestita a sei pozzetto contenente un millilitro di mezzo cellulare endoteliale.
Per la coltivazione, incubare le cellule a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica in un incubatore sterile, assicurandosi di rinfrescare il mezzo ogni due o tre giorni. Quando le cellule sono all'80-90% di confluenza, sciacquare due volte ciascuna cellule contenenti bene con due millilitri di PBS in due fasi di lavaggio consecutive. Quindi, aggiungere 800 microlitri di soluzione EDTA di tripside ad ogni pozzo e incubare a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% in un incubatore sterile per tre o cinque minuti.
Successivamente, aggiungere 1.200 microlitri di DMEM contenenti almeno il 10% di FCS per interrompere l'attività enzimatica. Centrifuga a 350 volte la gravità e a 20 gradi Celsius per cinque minuti. Quindi, accumulare le cellule CD31 come descritto in precedenza per aumentare la purezza.
Utilizzare un campo luminoso o un microscopio a contratto in fase standard con ingrandimento del 20% e apertura numerica dell'obiettivo 0,35 per osservare la confluenza cellulare. In questo studio, le cellule endoteliali del muscolo scheletrico murino primario sono isolate. Un giorno dopo l'isolamento, iMMEC murini primari e le altre cellule residue formano conglomerati e aderiscono al fondo dei piatti di coltura.
Dal settimo giorno in poi, si possono osservare cellule piatte e allungate, tuttavia, la contaminazione di altre cellule per lo più sferoidi è ancora visibile. Pertanto, è necessario un altro ciclo di selezione positiva del CD31 tramite MCS. Di seguito, leMMEC murine primarie proliferano ad una densità di circa l'80-90% Alla confluenza, in genere formano un monostrato non sovrapposto di celle allineate longitudinalmente.
La proliferazione si interrompe alla confluenza a causa dell'inibizione del contatto. Il controllo di qualità tramite citometria a flusso mostra valori sia per la vitalità che per la purezza che vanno intorno al 70% ciascuno per le cellule immediatamente dopo l'isolamento. Le cellule coltivate dopo un'altra selezione positiva di CD31 tramite MCS mostrano valori soddisfacenti per la purezza e per la vitalità, che vanno fino al 95% ciascuno.
Le cellule ottenute vengono quindi studiate per l'espressione genica dei geni marcatori cellulari satellitari muscolari accoppiati proteina scatola 7 e M-cadherina a livello di mRNA da PCR quantitativa. Come previsto, solo la frazione CD45-negativa, CD31-negativa così come le cellule muscolari murine primarie differenziate espresse box proteina 7 e M-cadherina, mentre CD45-negativo, CD31-positivo e leMMEC murine primarie sono negative per questi marcatori. Dopo il secondo passo MCS CD31, qPCR viene utilizzato per valutare l'espressione di proteine di giunzione strette nelleMMEC murine primarie confluenti.
Si vede che leMMEC murine primarie esprimono alti livelli di claudin-5, occludina e zonula occludens-1, mentre il pmMC mostra solo una bassa espressione di zonula occludens-1. Questa tecnica può essere eseguita in cinque o sei ore. Seguendo questo protocollo, altri metodi come i test di migrazione o gli esperimenti di sollecitazione a bassa cesoia possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive.
Dopo aver visto questo video, dovresti essere in grado di isolare le cellule endoteliali microvascolari primarie dai muscoli scheletrici per dissociazione meccanica ed enzimatica e smistamento delle cellule magnetiche.
