Il protocollo è molto significativo perché consente un uso rapido, facile e diretto di modelli di DNA lineare in sistemi di sintesi proteica privi di cellule, anche da parametri nativi di E.coli. I principali vantaggi sono la quantità di tempo risparmiata evitando la clonazione, le modifiche chimiche delle estremità lineari del DNA e gli integratori protettivi come il DNA gamma o chi. Poiché gli estratti di sintesi auto-segnalanti vengono sviluppati per diversi organismi di interesse, il nostro metodo presenta un modo per accelerare la prototipazione in tali estratti utilizzando il DNA lineare.
Per iniziare, striscia il ceppo BL21 Rosetta-2 delta recBCD da meno 80 gradi Celsius di glicerolo su una piastra di agar YTP 2x che contiene 10 microgrammi per millilitro di cloramfenicolo e incubare durante la notte a 37 gradi Celsius. Quindi, inoculare una singola colonia dalla piastra di agar in poco più di 40 millilitri di 2x YTP integrato con 10 microgrammi per millilitro di cloramfenicolo e incubare durante la notte a 37 gradi Celsius con agitazione di 200 giri / min. Successivamente, crea una sottocoltura diluendo la coltura notturna 100 volte in quattro litri di 2x YTP freschi contenenti 10 microgrammi per millilitro di cloramfenicolo.
Dividere i quattro litri del supporto in quattro palloni separati. Incubare a 37 gradi Celsius, 200 RPM, per circa tre o quattro ore di crescita per raggiungere una densità ottica da 1,5 a 2,0. Mettere la coltura sul ghiaccio, far girare le cellule a 5.000 G per 12 minuti a quattro gradi Celsius, quindi scartare il surnatante decantando.
Quindi, risospendere i pellet di cella in 800 millilitri di S30A refrigerato con DTT. Ancora una volta, ruotare le cellule a 5.000 G per 12 minuti a quattro gradi Celsius come dimostrato in precedenza e scartare il surnatante mediante decantazione. Dopo aver risospeso i pellet cellulari in 160 millilitri di S30A refrigerato con DTT, trasferire le celle in tubi da 50 millilitri refrigerati e prepesati.
Ruotare le cellule a 2000 G per otto minuti a quattro gradi Celsius e quindi scartare il surnatante decantando. Ancora una volta, ruotare le cellule a 2000 G per quattro minuti a quattro gradi Celsius, quindi rimuovere con attenzione il surnatante rimanente usando una pipetta. Quindi, rimisurare il peso del tubo per calcolare il peso del pellet cellulare e mantenere i pellet cellulari a meno 80 gradi Celsius.
Dopo aver prelevato i pellet cellulari da meno 80 gradi Celsius, scongelarli sul ghiaccio per una o due ore e risospendere i pellet cellulari in 0,9 millilitri di S30A con tampone DTT per grammo del peso del pellet cellulare. Quindi, pipettare lentamente per risospendere le cellule, evitando il più possibile la schiuma superiore. Posizionare aliquote da un millilitro delle celle risospese in microtubi da 1,5 millilitri e tenerli su ghiaccio o un blocco freddo pre-raffreddato a quattro gradi Celsius.
Quindi, sonicare ogni tubo in un sonicatore con una configurazione del 20% di ampiezza per tre cicli e ruotare il lisato a 12.000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver raccolto il surnatante con una pipetta, trasferire su un tubo da 50 millilitri. Incubare il lisato cellulare a 37 gradi Celsius a 200 RPM agitazione per 80 minuti.
Dopo aver fatto girare il lisato e raccolto il surnatante in microtubi da 1,5 millilitri pre-raffreddati, aliquote 30 microlitri in provette PCR 8-strip pre-raffreddate, mantenendo tutti i tubi sul ghiaccio. Flash congelare le aliquote di lisato su ghiaccio secco e conservare a meno 80 gradi Celsius. Preparare un master mix in base alla scheda di preparazione del buffer come descritto nel manoscritto.
Per un volume di reazione di 10,5 microlitri, aggiungere 1,05 microlitri di diverse concentrazioni di Mg-glutammato e 9,45 microlitri del master mescolare e mescolare delicatamente. Pipettare 10 microlitri delle reazioni di cui sopra in una micropiastra inferiore quadrata a 384 pozzetti e coprirla con un sigillo adesivo. Misurare l'espressione genica come output di fluorescenza registrando i dati di fluorescenza con un lettore di piastre a intervalli regolari per otto ore di incubazione a 30 gradi Celsius con scuotimento orbitale continuo a 307 cicli al minuto.
Dopo aver identificato la concentrazione di Mg-glutammato che si traduce nel più alto valore di fluorescenza nel punto finale, procedere alla calibrazione del K-glutammato. Esegui l'esperimento e identifica il più alto valore di fluorescenza tra le concentrazioni di K-glutammato testate, identificando così la composizione tampone ottimale per Mg-glutammato e K-glutammato per questo lisato. Una volta stabiliti i valori di Mg-glutammato e K-glutammato, preparare provette stock della composizione tampone ottimizzata in base al volume del lotto ottenuto.
Dopo aver calcolato il numero di tubi tampone necessari, aliquote 38 microlitri per tubo e conservare a meno 80 gradi Celsius. Innanzitutto, etichettare un microtubo da 1,5 millilitri per la preparazione ottimale del master mix. Aggiungere i volumi corretti del tampone e del lisato e mescolarli delicatamente.
Quindi, pipettare prima i campioni di DNA, seguiti da acqua priva di nucleasi e, infine, il master mix ottimale. Mescolare delicatamente la reazione priva di cellule con una pipetta appena prima di aggiungere al lettore di piastre ed evitare eventuali bolle. Dopo aver impostato le reazioni nel lettore di piastre, le corse cinetiche hanno registrato i dati di fluorescenza a intervalli regolari per otto ore di incubazione a 30 gradi Celsius con scuotimento orbitale continuo a 307 cicli al minuto.
Dopo la calibrazione del lisato, la concentrazione ottimale di Mg-glutammato era simile a otto millimolari tra gli estratti sia per il DNA lineare che per quello plasmide. Tuttavia, la concentrazione ottimale di K-glutammato per il DNA plasmidico è di 140 millimolari, mentre la concentrazione ottimale di K-glutammato per il DNA lineare è di 20 millimolari. Dopo le fasi di calibrazione, i livelli di espressione GFP sono stati confrontati tra DNA lineare e plasmidico negli estratti wild-type, delta recB e delta recBCD.
L'espressione di GFP dal DNA lineare ha raggiunto rispettivamente il 102% e il 138% dell'espressione dal DNA plasmidico negli estratti dei ceppi delta recB e delta recBCD. Le cose più importanti nel protocollo sono la lisi sonicativa della cellula e le fasi di calibrazione del tampone separatamente per il DNA lineare e plasmide, in particolare quando si utilizzano i parametri nativi. Questa tecnica contribuirebbe ad accelerare la sperimentazione di progetti biologici in sistemi privi di cellule, ad esempio lo screening di biosensori, enzimi e percorsi o la prototipazione di circuiti genetici sintetici.
