Controlli positivi e negativi del pellet cellulare ben caratterizzati con livelli definiti di espressione proteica o trascritta sono essenziali per lo sviluppo di saggi immunoistochimici. Questo protocollo descrive un processo per la creazione e l'elaborazione di controlli di pellet cellulari fissi con paraffina. Tali controlli possono essere utilizzati per caratterizzare la specificità di legame durante lo sviluppo di un nuovo saggio immunoistochimico.
I saggi IHC sono fondamentali per i nostri sforzi di scoperta e sviluppo di biomarcatori in tutte le aree terapeutiche e lo sviluppo di controlli convalidati è essenziale per lo sviluppo di questi test. È essenziale riscaldare il gel a base di idrossietilagarosio ad almeno 40 gradi Celsius prima di aggiungerlo al pellet cellulare. Il gel deve essere ben miscelato con le cellule prima di solidificarsi.
Inizia la fissazione del pellet di 293 celle aggiungendo 30 millilitri di formalina tamponata neutra al 10% a un pellet di celle da tre millilitri per creare un rapporto fissativo a cella di 10 a uno. Risospendere le celle invertendo ripetutamente il tubo da 50 millilitri strettamente tappato e lasciarle depositare durante la notte a temperatura ambiente. Per migliorare la fissazione, aumentare il rapporto superficie/volume invertendo il tubo il giorno successivo e risospendendo le celle.
Dopo 24 ore di fissaggio, centrifugare il tubo a 930 volte G a cinque gradi Celsius per 10-15 minuti. Assicurarsi che il pellet cellulare sia visibile e rimuovere il fissativo travasandolo o aspirandolo con cura utilizzando una pipetta di trasferimento sterile. Aggiungere gel fuso a base di idrossietilagarosio a 40-60 gradi Celsius al pellet con un rapporto da uno a quattro gel a cellula.
Utilizzare una sonda sterling pulita da cinque pollici e due millimetri con un occhio risciacquato con acqua di rubinetto per mescolare delicatamente il contenuto del tubo conico da 50 millilitri, creando una sospensione uniforme di cellule fisse nel gel fuso sul fondo. Dopo aver sospeso uniformemente le cellule fisse nel gel fuso, tappare il tubo cronico e posizionarlo sul ghiaccio bagnato per cinque-10 minuti. Una volta che il pellet di gel si solidifica, posizionare con attenzione una microspatola pulita lungo il lato del tubo e sfruttare delicatamente il pellet senza perforarlo.
Posizionare il pellet solidificato sulla carta da biopsia. Utilizzando una microspatola pulita, tagliare il pellet cellulare in fette spesse da quattro a cinque millimetri per adattarle a una cassetta di tessuto da 26 millimetri per 26 millimetri per cinque millimetri. Posizionare le singole fette di pellet di gel al centro di un pezzo di carta da biopsia.
Piegare i due lati opposti e avvolgere la fetta in carta prima di metterla in una cassetta di carta da 26 x 26 per cinque millimetri. Chiudere il coperchio. Posizionare la cassetta del pellet di cella tagliata nella storta del processore tissutale riempita con formalina tamponata neutra al 10% ed eseguire un breve programma di elaborazione.
Per incorporare il pellet cellulare, posizionare le cassette lavorate nell'area di attesa del centro di incorporamento. Aprire il coperchio della cassetta del tessuto e aprire con attenzione la carta da biopsia. Posizionare il pellet cellulare in un piccolo stampo monouso da 15 x 15 millimetri con il lato tagliato verso il basso.
Mentre si tiene delicatamente il pellet cellulare sul fondo dello stampo con una pinza, aggiungere un'infiltrazione tissutale di 62 gradi Celsius o incorporare la paraffina nello stampo, coprendo il pellet cellulare. Spostare lo stampo in un blocco freddo per solidificare la paraffina. Regolare il pellet cellulare mentre la paraffina si sta solidificando e fissarlo nella posizione appropriata sul fondo dello stampo.
Rimuovere il coperchio dalla cassetta. Posizionare il lato inferiore della cassetta sopra lo stampo incorporato e aggiungere ulteriore paraffina fusa per coprire la cassetta. Quando la paraffina viene riempita sulla cassetta di tessuto, riportare lo stampo nel blocco freddo per la solidificazione.
Prelevare le sezioni di paraffina preparate con il microtomo rotante dal bagno di flottazione su vetrini caricati positivamente. Posizionare la prima sezione nella parte superiore della diapositiva all'interno del bordo della vetrina e della colorazione, quindi posizionare in serie le sezioni successive una sotto l'altra. Una volta fatto, asciugare i vetrini inizialmente a 23 gradi Celsius per 24 ore, poi a 60 gradi Celsius per 30 minuti.
Il pellet cellulare incorporato preparato con questo metodo ha mostrato una distribuzione uniforme delle cellule in tutta la sezione, con aggregazione minima delle cellule e interazioni nel pellet. Quando l'immunomarcatura è stata visualizzata con il diaminobenzene bruno, il cromogeno e tre linee cellulari sono stati osservati livelli variabili dell'espressione del fattore di trascrizione TEAD nel nucleo, che vanno da no, a debole, all'espressione forte. L'incorporazione dei pellet di cella in un microarray ha permesso la valutazione di controlli con diversi livelli di espressione nello stesso vetrino senza variazioni nelle procedure.
Come mostrato in questo esempio, si può osservare un controllo negativo delle cellule staminali embrionali di topo carenti di PEG 10 e un controllo positivo delle cellule 293T che sovraesprimono PEG 10. Garantire che le cellule siano fissate adeguatamente e distribuite in modo omogeneo in tutto il pellet di gel crea un controllo uniforme del dosaggio standardizzato. I pellet cellulari possono essere utilizzati come controlli nei saggi di immunoistochimica a valle e ibridazione NC2 con metodi standard di recupero ed etichettatura dell'antigene.
I controlli del pellet cellulare hanno permesso lo sviluppo di molti saggi immunoistochimici, in particolare per proteine nuove o minimamente caratterizzate. Servono come controlli ben definiti che possono aiutare a caratterizzare la specificità degli anticorpi.
