Controles de pellets celulares positivos e negativos bem caracterizados com níveis definidos de expressão de proteínas ou transcritos são essenciais para o desenvolvimento de ensaios imuno-histoquímicos. Este protocolo descreve um processo para criar e processar controles de pellets de células fixas e embutidas em parafina. Tais controles podem ser usados para caracterizar a especificidade de ligação durante o desenvolvimento de um novo ensaio imuno-histoquímico.
Os ensaios de IHC são críticos para nossos esforços de descoberta e desenvolvimento de biomarcadores em todas as áreas terapêuticas, e o desenvolvimento de controles validados é essencial para o desenvolvimento desses ensaios. É essencial aquecer o gel à base de hidroxietila agarose a pelo menos 40 graus Celsius antes de adicioná-lo ao pellet celular. O gel deve ser bem misturado com as células antes de se solidificar.
Comece a fixação do pellet de célula 293T adicionando 30 mililitros de formalina tamponada 10% neutra a um pellet de célula de três mililitros para criar uma proporção de 10 para um fixador para célula. Ressuspenda as células invertendo repetidamente o tubo de 50 mililitros bem tampado e deixe-as assentar durante a noite à temperatura ambiente. Para melhorar a fixação, aumente a relação superfície/volume, invertendo o tubo no dia seguinte e ressuspendendo as células.
Após 24 horas de fixação, centrifugar o tubo a 930 vezes G a cinco graus Celsius por 10 a 15 minutos. Certifique-se de que o pellet de célula esteja visível e remova o fixador decantando-o ou aspirando-o cuidadosamente usando uma pipeta de transferência estéril. Adicione o gel à base de hidroxietila agarose derretida a 40 a 60 graus Celsius ao pellet em uma proporção de um a quatro gel para pellet celular.
Use uma sonda limpa de cinco polegadas e duas milímetros com um olho enxaguado com água da torneira para agitar suavemente o conteúdo do tubo cônico de 50 mililitros, criando uma suspensão uniforme de células fixas no gel derretido na parte inferior. Depois de suspender uniformemente as células fixas no gel derretido, tampe o tubo crônico e coloque-o no gelo molhado por cinco a 10 minutos. Uma vez que o pellet de gel se solidifique, coloque cuidadosamente uma microespátula limpa ao longo do lado do tubo e aproveite suavemente o pellet sem perfurá-lo.
Coloque o pellet solidificado no papel da biópsia. Usando uma microespátula limpa, corte a pastilha de célula em fatias de quatro a cinco milímetros de espessura para caber em um de tecido de 26 milímetros por 26 milímetros por cinco milímetros. Coloque fatias individuais de pellets de gel no centro de um pedaço de papel de biópsia.
Dobre os dois lados opostos e embrulhe a fatia em papel antes de colocá-la em um de tecido de 26 por 26 por cinco milímetros. Feche a tampa. Coloque o de pellets de célula aparado na réplica do processador de tecido preenchida com formalina tamponada 10% neutra e execute em um curto cronograma de processamento.
Para incorporar o pellet de célula, coloque as processadas na área de retenção do centro de incorporação. Abra a tampa do de tecido e desdobre cuidadosamente o papel da biópsia. Coloque o pellet de célula em um pequeno molde de incorporação descartável de 15 por 15 milímetros em lado cortado para baixo.
Ao segurar suavemente a pastilha de célula no fundo do molde com pinça, adicione infiltração de tecido de 62 graus Celsius ou incorpore parafina no molde, cobrindo a pastilha de célula. Mova o molde para um bloco frio para solidificar a parafina. Ajuste o pellet de célula enquanto a parafina está se solidificando e fixe-o na posição apropriada na parte inferior do molde.
Retire a tampa do. Coloque a parte inferior do de lado para baixo em cima do molde de incorporação e adicione parafina derretida extra para cobrir o. Quando a parafina for preenchida sobre o de tecido, devolva o molde ao bloco frio para solidificação.
Pegue as seções de parafina preparadas usando o micrótomo rotativo do banho de flutuação em lâminas carregadas positivamente. Coloque a primeira seção na parte superior do slide dentro do limite de deslizamento e coloração da tampa e, em seguida, coloque as próximas seções em série como uma abaixo da outra. Uma vez feito, seque as lâminas inicialmente a 23 graus Celsius por 24 horas, depois a 60 graus Celsius por 30 minutos.
O pellet de célula incorporado preparado usando este método mostrou uma distribuição celular uniforme ao longo da seção, com aglomeração celular mínima e interações no pellet. Quando a imunomarcação foi visualizada com o diaminobenzeno marrom, cromogênio e três linhagens celulares foram observados níveis variados de expressão do fator de transcrição TEAD no núcleo, variando de não, a fraco, à expressão forte. A incorporação dos pellets celulares em um microarray permitiu a avaliação de controles com diferentes níveis de expressão em uma mesma lâmina sem variação nos procedimentos.
Como mostrado neste exemplo, o controle negativo de células-tronco embrionárias de camundongos deficientes em PEG 10 e o controle positivo de células-T 293T superexpressando PEG 10 podem ser vistos. Garantir que as células sejam fixadas adequadamente e distribuídas homogeneamente em todo o pellet de gel cria um controle de ensaio padronizado uniforme. Os pellets celulares podem ser usados como controles em ensaios de imuno-histoquímica a jusante e hibridização NC2 com métodos padrão de recuperação e marcação de antígenos.
Os controles de pellets celulares permitiram o desenvolvimento de muitos ensaios imuno-histoquímicos, particularmente para proteínas novas ou minimamente caracterizadas. Eles servem como controles bem definidos que podem ajudar a caracterizar a especificidade dos anticorpos.
