Los controles de pellets celulares positivos y negativos bien caracterizados con niveles definidos de expresión de proteínas o transcripciones son esenciales para desarrollar ensayos inmunohistoquímicos. Este protocolo describe un proceso para crear y procesar controles de pellets celulares fijados con fórmula fija e incrustada en parafina. Dichos controles se pueden utilizar para caracterizar la especificidad de unión mientras se desarrolla un nuevo ensayo inmunohistoquímico.
Los ensayos IHQ son fundamentales para nuestros esfuerzos de descubrimiento y desarrollo de biomarcadores en todas las áreas terapéuticas, y el desarrollo de controles validados es esencial para desarrollar estos ensayos. Es esencial calentar el gel a base de hidroxietil agarosa a al menos 40 grados centígrados antes de agregarlo al pellet celular. El gel debe estar bien mezclado con las células antes de solidificarse.
Comience la fijación del pellet de células 293T agregando 30 mililitros de formalina tamponada neutra al 10% a un pellet de tres mililitros de células para crear una proporción fijadora a célula de 10 a uno. Resuspenda las células invirtiendo repetidamente el tubo de 50 mililitros bien tapado y deje que se asienten durante la noche a temperatura ambiente. Para mejorar la fijación, aumente la relación superficie-volumen invirtiendo el tubo al día siguiente y resuspendiendo las células.
Después de 24 horas de fijación, centrifugar el tubo a 930 veces G a cinco grados centígrados durante 10 a 15 minutos. Asegúrese de que el pellet de células sea visible y retire el fijador decantándolo o aspirándolo cuidadosamente con una pipeta de transferencia estéril. Agregue gel a base de hidroxietil agarosa fundida a 40 a 60 grados centígrados al pellet en una proporción de uno a cuatro gel a pellets celulares.
Use una sonda de punta esterlina limpia de cinco pulgadas y dos milímetros con un ojo enjuagado con agua del grifo para agitar suavemente el contenido del tubo cónico de 50 mililitros, creando una suspensión uniforme de células fijas en el gel fundido en la parte inferior. Después de suspender uniformemente las celdas fijas en el gel fundido, tapa el tubo de crónica y colócalo sobre el hielo húmedo durante cinco a 10 minutos. Una vez que el gránulo de gel se solidifique, coloque cuidadosamente una microespátula limpia a lo largo del costado del tubo y aproveche suavemente el pellet sin perforarlo.
Coloque el pellet solidificado sobre el papel de biopsia. Usando una microespátula limpia, recorte el pellet celular en rodajas de cuatro a cinco milímetros de espesor para que quepan en un casete de tejido de 26 milímetros por 26 milímetros por cinco milímetros. Coloque rodajas individuales de gránulos en el centro de un pedazo de papel de biopsia.
Doble los dos lados opuestos y envuelva la rebanada en papel antes de colocarla en un casete de tejido de 26 por 26 por cinco milímetros. Cierre la tapa. Coloque el casete de pellets de células recortadas en la retorta del procesador de tejidos llena de formalina tamponada neutra al 10% y ejecútela en un programa de procesamiento corto.
Para incrustar el pellet de celda, coloque los casetes procesados en el área de retención del centro de incrustación. Abra la tapa del casete de tejido y despliegue cuidadosamente el papel de biopsia. Coloque el pellet de la celda en un pequeño molde desechable de 15 por 15 milímetros en el lado cortado hacia abajo.
Mientras sostiene suavemente el pellet celular en el fondo del molde con fórceps, agregue infiltración de tejido a 62 grados centígrados o incruste parafina en el molde, cubriendo el pellet celular. Mueva el molde a un bloque frío para solidificar la parafina. Ajuste el pellet de la celda mientras la parafina se solidifica y fíjelo en la posición adecuada en la parte inferior del molde.
Retire la tapa del cassette. Coloque el cassette con el lado inferior hacia abajo sobre el molde de incrustación y agregue parafina fundida adicional para cubrir el cassette. Cuando la parafina se llene sobre el casete de tejido, devuelva el molde al bloque frío para su solidificación.
Recoger las secciones de parafina preparadas con el microscopio rotativo del baño de flotación en portaobjetos cargados positivamente. Coloque la primera sección en la parte superior de la diapositiva dentro del límite de la hoja de cubierta y la tinción, luego coloque en serie las siguientes secciones como una debajo de la otra. Una vez hecho esto, seque los portaobjetos inicialmente a 23 grados centígrados durante 24 horas, luego a 60 grados centígrados durante 30 minutos.
El pellet celular incrustado preparado utilizando este método mostró una distribución celular uniforme en toda la sección, con un mínimo de aglutinación celular e interacciones en el pellet. Cuando se visualizó inmunomarcaje con el diaminobenceno marrón, el cromógeno y tres líneas celulares, se observaron niveles variables de expresión del factor de transcripción TEAD en el núcleo, que van desde no, a débil, a la expresión fuerte. La incorporación de los pellets celulares en un microarray permitió la evaluación de controles con diferentes niveles de expresión en el mismo portaobjetos sin variación en los procedimientos.
Como se muestra en este ejemplo, se puede ver el control negativo de las células madre embrionarias de ratón deficientes en PEG 10 y el control positivo de las células 293T que sobreexpresan PEG 10. Asegurar que las células estén fijadas adecuadamente y distribuidas homogéneamente en todo el gel de gel crea un control de ensayo estandarizado uniforme. Los gránulos celulares se pueden utilizar como controles en inmunohistoquímica posterior y ensayos de hibridación NC2 con métodos estándar de recuperación y etiquetado de antígenos.
Los controles de pellets celulares han permitido el desarrollo de muchos ensayos inmunohistoquímicos, particularmente para proteínas nuevas o mínimamente caracterizadas. Sirven como controles bien definidos que pueden ayudar a caracterizar la especificidad de los anticuerpos.
