Tanımlanmış protein veya transkript ekspresyon düzeylerine sahip iyi karakterize pozitif ve negatif hücre pelet kontrolleri, immünohistokimya tahlillerinin geliştirilmesi için gereklidir. Bu protokol, formül sabit, parafin gömülü hücre pelet kontrollerinin oluşturulması ve işlenmesi için bir süreci açıklar. Bu kontroller, yeni bir immünohistokimya testi geliştirirken bağlanma özgüllüğünü karakterize etmek için kullanılabilir.
IHC testleri, terapötik alanlardaki keşif ve biyobelirteç geliştirme çabalarımız için kritik öneme sahiptir ve doğrulanmış kontrollerin geliştirilmesi, bu tahlillerin geliştirilmesi için gereklidir. Hidroksietil agaroz bazlı jeli, hücre peletine eklemeden önce en az 40 santigrat dereceye ısıtmak önemlidir. Jel, katılaşmadan önce hücrelerle iyice karıştırılmalıdır.
293T hücreli peletin fiksasyonuna, 10'a bir fiksatif hücre oranı oluşturmak için üç mililitrelik bir hücre peletine 30 mililitre% 10 nötr tamponlu formalin ekleyerek başlayın. Sıkıca kapatılmış 50 mililitrelik tüpü tekrar tekrar ters çevirerek hücreleri yeniden askıya alın ve gece boyunca oda sıcaklığında yerleşmelerine izin verin. Fiksasyonu iyileştirmek için, ertesi gün tüpü ters çevirerek ve hücreleri yeniden askıya alarak yüzey-hacim oranını artırın.
24 saatlik fiksasyondan sonra, tüpü 10 ila 15 dakika boyunca beş santigrat derecede 930 kez G'de santrifüj edin. Hücre peletinin görünür olduğundan emin olun ve steril bir transfer pipeti kullanarak dekantasyonu yaparak veya dikkatlice aspire ederek fiksatifi çıkarın. Erimiş hidroksietil agaroz bazlı jeli 40 ila 60 santigrat derecede pelete bir ila dört jel hücre pelet oranında ekleyin.
50 mililitrelik konik tüpün içeriğini nazikçe karıştırmak için musluk suyuyla durulanmış bir gözle temiz bir beş inç ve iki milimetre uçlu sterling probu kullanın ve alttaki erimiş jelde sabit hücrelerin eşit bir süspansiyonunu oluşturun. Erimiş jeldeki sabit hücreleri eşit şekilde askıya aldıktan sonra, kroniksel tüpü kapatın ve beş ila 10 dakika boyunca ıslak buzun üzerine yerleştirin. Jel pelet katılaştıktan sonra, tüpün yan tarafına dikkatlice temiz bir mikrospatula yerleştirin ve peleti delmeden yavaşça kullanın.
Katılaşmış peleti biyopsi kağıdına yerleştirin. Temiz bir mikrospatula kullanarak, hücre peletini 26 milimetre x 26 milimetre x beş milimetre doku kasetine sığacak şekilde dört ila beş milimetre kalınlığında dilimler halinde kesin. Tek tek jel pelet dilimlerini bir parça biyopsi kağıdının ortasına yerleştirin.
İki zıt tarafı katlayın ve dilimi 26 x 26 x beş milimetrelik bir doku kasetine yerleştirmeden önce kağıda sarın. Kapağı kapatın. Kesilmiş hücre pelet kasetini% 10 nötr tamponlu formalin ile doldurulmuş doku işlemcisi imbiğine yerleştirin ve kısa bir işleme programına göre çalıştırın.
Hücre peletini gömmek için, işlenmiş kasetleri gömme merkezinin tutma alanına yerleştirin. Doku kaseti kapağını açın ve biyopsi kağıdını dikkatlice açın. Hücre peletini 15 x 15 milimetrelik tek kullanımlık küçük bir gömme kalıbına kesilmiş tarafa yerleştirin.
Hücre peletini forseps ile kalıbın dibinde nazikçe tutarken, 62 santigrat derece doku infiltrasyonu ekleyin veya hücre peletini kaplayan kalıba parafin yerleştirin. Parafini katılaştırmak için kalıbı soğuk bir bloğa taşıyın. Parafin katılaşırken hücre peletini ayarlayın ve kalıbın dibinde uygun konuma sabitleyin.
Kapağı kasetten çıkarın. Kaseti alt tarafını gömme kalıbının üstüne yerleştirin ve kaseti örtmek için ekstra erimiş parafin ekleyin. Parafin doku kaseti üzerine doldurulduğunda, katılaşma için kalıbı soğuk bloğa geri koyun.
Döner mikrotom kullanılarak hazırlanan parafin kesitlerini yüzdürme banyosundan pozitif yüklü slaytlara alın. İlk bölümü slaytın üst kısmına, kapak kayması ve boyama sınırı içine yerleştirin, ardından sonraki bölümleri seri olarak birbirinin altına yerleştirin. Tamamlandığında, slaytları başlangıçta 24 saat boyunca 23 santigrat derecede, daha sonra 30 dakika boyunca 60 santigrat derecede kurutun.
Bu yöntem kullanılarak hazırlanan gömülü hücre peleti, kesit boyunca eşit bir hücre dağılımı gösterdi, minimum hücre kümelenmesi ve peletteki etkileşimler vardı. İmmünoetiketleme kahverengi diaminobenzen ile görselleştirildiğinde, kromozom ve üç hücre çizgisi, çekirdekte TEAD transkripsiyon faktörü ekspresyonunun farklı seviyelerinde, hayır'dan zayıfa, güçlü ekspresyona kadar değişen seviyelerde gözlendi. Hücre peletlerinin bir mikrodiziye dahil edilmesi, prosedürlerde değişiklik olmaksızın aynı slaytta değişen ekspresyon seviyelerine sahip kontrollerin değerlendirilmesine izin verdi.
Bu örnekte gösterildiği gibi, PEG 10 eksik fare embriyonik kök hücrelerinin negatif kontrolü ve PEG 10'u aşırı eksprese eden 293T hücrelerinin pozitif kontrolü görülebilir. Hücrelerin yeterince sabitlenmesini ve jel pelet boyunca homojen bir şekilde dağıtılmasını sağlamak, tek tip standartlaştırılmış bir tahlil kontrolü oluşturur. Hücre peletleri, standart antijen geri kazanımı ve etiketleme yöntemleri ile aşağı akış immünohistokimya ve NC2 hibridizasyon testlerinde kontrol olarak kullanılabilir.
Hücre pelet kontrolleri, özellikle yeni veya minimal olarak karakterize edilen proteinler için birçok immünohistokimya testinin geliştirilmesini sağlamıştır. Antikor özgüllüğünü karakterize etmeye yardımcı olabilecek iyi tanımlanmış kontroller olarak hizmet ederler.
