Хорошо охарактеризованные положительные и отрицательные клеточные гранулы с определенными уровнями экспрессии белка или транскрипта необходимы для разработки иммуногистохимических анализов. Этот протокол описывает процесс создания и обработки формулы фиксированных, парафиновых элементов управления гранулами клеток. Такие средства контроля могут быть использованы для характеристики специфичности связывания при разработке нового иммуногистохимического анализа.
Анализы IHC имеют решающее значение для наших усилий по открытию и разработке биомаркеров в терапевтических областях, и разработка проверенных средств контроля имеет важное значение для разработки этих анализов. Важно нагреть гель на основе гидроксиэтилагарозы по крайней мере до 40 градусов Цельсия перед добавлением его в гранулу клетки. Гель должен быть хорошо смешан с клетками перед затвердеванием.
Начните фиксацию гранулы 293T-клеток с добавления 30 миллилитров 10% нейтрального буферизованного формалина к трехмиллилитровой ячейке гранулы для создания фиксаторного отношения к ячейке 10 к одному. Повторно суспендируйте клетки, многократно инвертируя плотно закрытую 50-миллилитровую трубку, и позвольте им осесть на ночь при комнатной температуре. Чтобы улучшить фиксацию, увеличьте отношение поверхности к объему, перевернув трубку на следующий день и повторно развернув клетки.
После 24 часов фиксации центрифугируйте трубку в 930 раз G при пяти градусах Цельсия в течение 10-15 минут. Убедитесь, что ячейка гранулы видна, и удалите фиксатор, декантируя или тщательно аспирируя его с помощью стерильной переносной пипетки. Добавьте расплавленный гель на основе гидроксиэтилагарозы при температуре от 40 до 60 градусов Цельсия к грануле в соотношении от одного до четырех гелей к гранулам ячейки.
Используйте чистый пятидюймовый и двухмиллиметровый наконечник стерлингового зонда с глазом, промытым водопроводной водой, чтобы осторожно перемешать содержимое конической трубки объемом 50 миллилитров, создавая равномерную суспензию фиксированных клеток в расплавленном геле на дне. После равномерной приостановки неподвижных клеток в расплавленном геле, закройте клетку хроники и поместите ее на влажный лед на пять-10 минут. Как только гелевая гранула затвердеет, аккуратно поместите чистый микропаток вдоль боковой стороны трубки и осторожно используйте гранулу, не прокалывая ее.
Поместите затвердевшую гранулу на биопсийную бумагу. Используя чистый микропатул, обрежьте гранулу ячейки на срезы толщиной от четырех до пяти миллиметров, чтобы поместиться в тканевую кассету размером 26 на 26 миллиметров на пять миллиметров. Поместите отдельные ломтики гелевых гранул в центр куска биопсийной бумаги.
Сложите две противоположные стороны и заверните срез в бумагу, прежде чем поместить его в тканевую кассету размером 26 на 26 на пять миллиметров. Закройте крышку. Поместите обрезанную ячейку гранулированной кассеты в реторту тканевого процессора, заполненную 10% нейтральным буферизованным формалином, и выполняйте короткую график обработки.
Для встраивания гранулы ячейки поместите обработанные кассеты в зону удержания центра встраивания. Откройте крышку тканевой кассеты и аккуратно разверните бумагу для биопсии. Поместите ячейку гранулы в небольшую одноразовую встраиваемую форму размером 15 на 15 миллиметров в разрезанную сторону вниз.
Осторожно удерживая ячейку гранулы в нижней части формы щипцами, добавьте 62 градуса Цельсия тканевую инфильтрацию или встраивая парафин в форму, покрывая ячейку гранулы. Переместите форму в холодный блок, чтобы затвердеть парафин. Отрегулируйте гранулу ячейки, пока парафин затвердевает, и зафиксируйте ее в соответствующем положении в нижней части формы.
Снимите крышку с кассеты. Поместите кассету снизу вниз поверх формы для встраивания и добавьте дополнительный расплавленный парафин, чтобы покрыть кассету. Когда парафин заполнен поверх тканевой кассеты, верните форму в холодный блок для затвердевания.
Подберите парафиновые секции, приготовленные с помощью ротационного микротома, из флотационной ванны на положительно заряженные слайды. Поместите первую секцию в верхнюю часть слайда в пределах границы проскальзывания и окрашивания крышки, затем последовательно разместите следующие секции как одну под другой. После этого высушите горки сначала при 23 градусах Цельсия в течение 24 часов, затем при 60 градусах Цельсия в течение 30 минут.
Внедренная клеточная гранула, приготовленная с использованием этого метода, показала равномерное распределение клеток по всему участку с минимальным слипанием клеток и взаимодействиями в грануле. Когда иммуномаркировка визуализировалась с помощью коричневого диаминобензола, хромогена и трех клеточных линий, в ядре наблюдались различные уровни экспрессии транскрипционного фактора TEAD, начиная от нет, до слабой, до сильной экспрессии. Включение клеточных гранул в микрочип позволило оценить элементы управления с различными уровнями экспрессии в одном и том же слайде без изменений в процедурах.
Как показано в этом примере, можно увидеть отрицательный контроль эмбриональных стволовых клеток мышей с дефицитом ПЭГ 10 и положительный контроль 293T-клеток, чрезмерно экспрессирующих ПЭГ 10. Обеспечение адекватной фиксации клеток и однородного распределения по всей грануле геля создает единый стандартизированный контроль анализа. Клеточные гранулы могут быть использованы в качестве средств контроля в последующей иммуногистохимии и гибридизации NC2 со стандартными методами извлечения и маркировки антигена.
Контроль клеточных гранул позволил разработать многие иммуногистохимические анализы, особенно для новых или минимально охарактеризованных белков. Они служат хорошо определенным контролем, который может помочь охарактеризовать специфичность антител.
