정의된 단백질 또는 전사체 발현 수준을 가진 잘 특성화된 양성 및 음성 세포 펠릿 대조군은 면역조직화학 분석을 개발하는 데 필수적입니다. 이 프로토콜은 수식 고정, 파라핀 내장 세포 펠릿 제어를 만들고 처리하는 프로세스를 설명합니다. 이러한 대조군은 새로운 면역조직화학 분석을 개발하는 동안 결합 특이성을 특성화하는데 사용될 수 있다.
IHC 분석은 치료 영역 전반에 걸친 당사의 발견 및 바이오마커 개발 노력에 매우 중요하며, 검증된 대조군을 개발하는 것은 이러한 분석을 개발하는 데 필수적입니다. 하이드록시에틸 아가로오스계 겔을 셀 펠릿에 추가하기 전에 섭씨 40도 이상으로 가열하는 것이 필수적입니다. 겔은 응고되기 전에 세포와 잘 혼합되어야합니다.
293 밀리리터 셀 펠릿에 10 % 중성 완충 포르말린 30 밀리리터를 추가하여 10 대 1 고정 대 세포 비율을 생성하여 10T 셀 펠릿의 고정을 시작하십시오. 단단히 뚜껑을 덮은 50 밀리리터 튜브를 반복적으로 뒤집어 세포를 재현 탁시키고 실온에서 밤새 침전시킵니다. 고정을 개선하려면 다음날 튜브를 뒤집고 세포를 다시 부유시켜 표면 대 부피 비율을 높입니다.
고정 24 시간 후, 섭씨 5도에서 930 배 G에서 튜브를 10-15 분 동안 원심 분리합니다. 세포 펠릿이 보이는지 확인하고 멸균 이송 피펫을 사용하여 디캔팅하거나 조심스럽게 흡인하여 고정액을 제거합니다. 섭씨 40 내지 60도에서 용융된 하이드록시에틸 아가로오스계 겔을 1 내지 4 겔 대 셀 펠렛 비율로 펠렛에 첨가한다.
수돗물로 헹구어 낸 눈으로 깨끗한 5 인치 및 2mm 팁 스털링 프로브를 사용하여 50 밀리리터 원추형 튜브의 내용물을 부드럽게 저어 바닥의 용융 젤에 고정 된 셀의 균일 한 현탁액을 만듭니다. 고정 된 세포를 용융 겔에 고르게 현탁시킨 후 크로니클 튜브를 캡핑하고 5-10 분 동안 젖은 얼음 위에 놓습니다. 젤 펠릿이 고형화되면 튜브 측면을 따라 깨끗한 미세 주걱을 조심스럽게 놓고 펠릿을 뚫지 않고 부드럽게 활용합니다.
응고된 펠릿을 생검 용지에 놓습니다. 깨끗한 미세 주걱을 사용하여 셀 펠릿을 26mm x 26mm x 5mm 조직 카세트에 맞도록 4-5mm 두께의 조각으로 자릅니다. 개별 젤 펠릿 조각을 생검 용지 중앙에 놓습니다.
반대쪽 두 면을 접고 슬라이스를 종이에 싸서 26 x 26 x 5mm 티슈 카세트에 넣습니다. 뚜껑을 닫습니다. 트리밍된 셀 펠릿 카세트를 10%중성 완충 포르말린으로 채워진 티슈 프로세서 레토르트에 넣고 짧은 처리 일정으로 실행합니다.
셀 펠릿을 매립하려면 처리된 카세트를 매립 센터의 고정 영역에 놓습니다. 티슈 카세트 뚜껑을 열고 생검 용지를 조심스럽게 펼칩니다. 셀 펠릿을 절단면이 아래로 향하도록 작은 15 x 15mm 일회용 임베딩 몰드에 넣습니다.
집게로 금형 바닥에 셀 펠릿을 부드럽게 잡고 섭씨 62도의 조직 침투 또는 파라핀을 금형에 삽입하여 셀 펠릿을 덮습니다. 몰드를 차가운 블록으로 옮겨 파라핀을 응고시킵니다. 파라핀이 응고되는 동안 셀 펠릿을 조정하고 금형 바닥의 적절한 위치에 고정합니다.
카세트에서 뚜껑을 제거합니다. 카세트 하단을 아래로 향하게 하여 임베딩 몰드 위에 놓고 용융 파라핀을 추가하여 카세트를 덮습니다. 파라핀이 티슈 카세트 위에 채워지면 응고를 위해 몰드를 콜드 블록으로 되돌립니다.
부유 수조에서 회전식 마이크로톰을 사용하여 준비된 파라핀 섹션을 양전하를 띤 슬라이드로 들어 올립니다. 슬라이드 상단의 첫 번째 섹션을 커버 슬립 및 염색 경계 내에 놓은 다음 다음 섹션을 다른 섹션 아래에 하나씩 직렬로 배치합니다. 완료되면 슬라이드를 처음에는 섭씨 23도에서 24시간 동안 건조시킨 다음 섭씨 60도에서 30분 동안 건조시킵니다.
이 방법을 사용하여 제조된 포매된 세포 펠릿은 펠릿 내에서 세포 응집 및 상호 작용을 최소화하면서 섹션 전체에 걸쳐 균일한 세포 분포를 보여주었습니다. 면역표지를 브라운 디아미노벤젠으로 시각화하였을 때, 발색원, 및 3개의 세포주에서 TEAD 전사인자 발현의 다양한 수준이 핵에서 관찰되었으며, 이는 없음에서 약함, 강한 발현에 이르기까지 다양하였다. 세포 펠릿을 마이크로어레이에 통합하면 절차의 변화 없이 동일한 슬라이드에서 다양한 발현 수준을 가진 대조군을 평가할 수 있었습니다.
본 실시예에서 보는 바와 같이, PEG 10 결핍 마우스 배아줄기세포의 음성대조군과 PEG10을 과발현하는 293T세포의 양성대조군을 알 수 있다. 세포가 적절하게 고정되고 겔 펠릿 전체에 균일하게 분포되도록 하면 균일한 표준화된 분석 제어가 생성됩니다. 세포 펠릿은 표준 항원 검색 및 표지 방법을 사용한 다운스트림 면역조직화학 및 NC2 혼성화 분석에서 대조군으로 사용할 수 있습니다.
세포 펠릿 제어는 특히 신규 또는 최소 특성화 단백질에 대한 많은 면역조직화학 분석의 개발을 가능하게 했습니다. 이들은 항체 특이성을 특성화하는 데 도움이 될 수 있는 잘 정의된 대조군 역할을 합니다.
