Gut charakterisierte positive und negative Zellpelletkontrollen mit definierten Protein- oder Transkriptexpressionsniveaus sind für die Entwicklung immunhistochemischer Assays unerlässlich. Dieses Protokoll beschreibt einen Prozess zur Erstellung und Verarbeitung von formelfixierten, paraffineingebetteten Zellpelletkontrollen. Solche Kontrollen können verwendet werden, um die Bindungsspezifität zu charakterisieren und gleichzeitig einen neuen immunhistochemischen Assay zu entwickeln.
IHC-Assays sind entscheidend für unsere Entdeckungs- und Biomarker-Entwicklungsbemühungen in allen therapeutischen Bereichen, und die Entwicklung validierter Kontrollen ist für die Entwicklung dieser Assays unerlässlich. Es ist wichtig, das Gel auf Hydroxyethylagarosebasis auf mindestens 40 Grad Celsius zu erhitzen, bevor es dem Zellpellet hinzugefügt wird. Das Gel muss vor dem Erstarren gut mit den Zellen gemischt werden.
Beginnen Sie die Fixierung des 293T-Zellpellets, indem Sie 30 Milliliter 10% neutrales gepuffertes Formalin zu einem Drei-Milliliter-Zellpellet hinzufügen, um ein Verhältnis von 10 zu eins Fixiermittel zu Zelle zu erzeugen. Resuspendieren Sie die Zellen durch wiederholtes Umdrehen des dicht verschlossenen 50-Milliliter-Röhrchens und lassen Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur absetzen. Um die Fixierung zu verbessern, erhöhen Sie das Verhältnis von Oberfläche zu Volumen, indem Sie die Röhre am nächsten Tag invertieren und die Zellen resuspendieren.
Nach 24 Stunden Fixierung zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 930 mal G bei fünf Grad Celsius für 10 bis 15 Minuten. Stellen Sie sicher, dass das Zellpellet sichtbar ist, und entfernen Sie das Fixiermittel durch Dekantieren oder vorsichtiges Absaugen mit einer sterilen Transferpipette. Fügen Sie geschmolzenes Hydroxyethyl-Agarose-basiertes Gel bei 40 bis 60 Grad Celsius in einem Verhältnis von ein bis vier Gel-Zell-Pellets zum Pellet hinzu.
Verwenden Sie eine saubere, fünf Zoll und zwei Millimeter große Sterlingsonde mit einem mit Leitungswasser gespülten Auge, um den Inhalt des 50-Milliliter-Konikusröhrchens vorsichtig zu rühren, wodurch eine gleichmäßige Suspension fester Zellen im geschmolzenen Gel am Boden entsteht. Nachdem Sie die fixierten Zellen gleichmäßig im geschmolzenen Gel suspendiert haben, verschließen Sie das Chronikröhrchen und legen Sie es für fünf bis 10 Minuten auf das nasse Eis. Sobald das Gelpellet verfestigt ist, legen Sie vorsichtig einen sauberen Mikrospatel entlang der Seite des Röhrchens und hebeln Sie das Pellet vorsichtig an, ohne es zu durchbohren.
Legen Sie das verfestigte Pellet auf das Biopsiepapier. Schneiden Sie das Zellpellet mit einem sauberen Mikrospatel in vier bis fünf Millimeter dicke Scheiben, damit es in eine 26 Millimeter mal 26 Millimeter mal fünf Millimeter große Gewebekassette passt. Legen Sie einzelne Gelpelletscheiben in die Mitte eines Biopsiepapiers.
Falten Sie die beiden gegenüberliegenden Seiten und wickeln Sie die Scheibe in Papier, bevor Sie sie in eine 26 x 26 mal fünf Millimeter große Taschentuchkassette legen. Schließen Sie den Deckel. Legen Sie die getrimmte Zellpelletkassette in die mit 10% neutralem gepuffertem Formalin gefüllte Gewebeverarbeitungsretorte und führen Sie sie nach einem kurzen Verarbeitungsplan aus.
Zum Einbetten des Zellpellets legen Sie die verarbeiteten Kassetten in den Haltebereich des Einbettzentrums. Öffnen Sie den Deckel der Taschentuchkassette und falten Sie das Biopsiepapier vorsichtig auseinander. Legen Sie das Zellpellet in eine kleine 15 x 15 Millimeter große Einweg-Einbettungsform mit der geschnittenen Seite nach unten.
Während Sie das Zellpellet vorsichtig mit einer Pinzette im Boden der Form halten, fügen Sie 62 Grad Celsius Gewebeinfiltration hinzu oder betten Sie Paraffin in die Form ein, um das Zellpellet zu bedecken. Bewegen Sie die Form in einen kalten Block, um das Paraffin zu verfestigen. Stellen Sie das Zellpellet ein, während das Paraffin erstarrt, und fixieren Sie es an der entsprechenden Position am Boden der Form.
Entfernen Sie den Deckel von der Kassette. Legen Sie die Kassette mit der Unterseite nach unten auf die Einbettungsform und fügen Sie zusätzliches geschmolzenes Paraffin hinzu, um die Kassette abzudecken. Wenn Paraffin über die Gewebekassette gefüllt ist, bringen Sie die Form zur Erstarrung in den kalten Block zurück.
Nehmen Sie die mit dem rotierenden Mikrotom präparierten Paraffinabschnitte aus dem Flotationsbad auf positiv geladene Objektträger auf. Platzieren Sie den ersten Abschnitt oben auf der Folie innerhalb des Deckstreifens und der Färbebegrenzung, und platzieren Sie dann nacheinander die nächsten Abschnitte untereinander. Danach trocknen Sie die Objektträger zunächst bei 23 Grad Celsius für 24 Stunden, dann bei 60 Grad Celsius für 30 Minuten.
Das eingebettete Zellpellet, das mit dieser Methode hergestellt wurde, zeigte eine gleichmäßige Zellverteilung über den gesamten Abschnitt mit minimaler Zellverklumpung und Wechselwirkungen im Pellet. Bei der Visualisierung der Immunmarkierung mit dem braunen Diaminbenzol, dem Chromogen und drei Zelllinien wurden unterschiedliche Niveaus der TEAD-Transkriptionsfaktorexpression im Zellkern beobachtet, die von no über schwach bis hin zur starken Expression reichten. Die Integration der Zellpellets in ein Microarray ermöglichte die Auswertung von Kontrollen mit unterschiedlichen Expressionsgraden im selben Objektträger ohne Variation in den Verfahren.
Wie in diesem Beispiel gezeigt, ist eine negative Kontrolle von PEG 10 defizienten embryonalen Stammzellen der Maus und eine positive Kontrolle von 293T-Zellen, die PEG 10 überexprimieren, zu sehen. Die Sicherstellung, dass die Zellen angemessen fixiert und homogen über das Gelpellet verteilt sind, schafft eine einheitliche standardisierte Assay-Kontrolle. Die Zellpellets können als Kontrollen in nachgeschalteten Immunhistochemie- und NC2-Hybridisierungsassays mit Standard-Antigen-Retrieval- und Markierungsmethoden verwendet werden.
Zellpellet-Kontrollen haben die Entwicklung vieler immunhistochemischer Assays ermöglicht, insbesondere für neuartige oder minimal charakterisierte Proteine. Sie dienen als gut definierte Kontrollen, die helfen können, die Antikörperspezifität zu charakterisieren.
