Il protocollo fornisce un'alternativa non chirurgica accurata, sicura ed efficiente ai tradizionali metodi chirurgici e di iniezione cieca. È anche la tecnica di iniezione più accurata per l'atrofia dei timo nei topi anziani o immunodeficienti. Il vantaggio principale è una procedura di iniezione minimamente stressante che è molto sicura e precisa, ma anche rapida, consentendo così esperimenti su larga scala senza compromettere i dati dall'immunosoppressione chirurgica correlata allo stress.
Mantenere l'allineamento dell'ago e del trasduttore mentre lo si avanza attraverso la parete toracica richiede un po 'di pratica. Si consiglia quindi di collaborare con un radiologo interventista esperto per eseguire iniezioni o fornire formazione. Ad aiutare a dimostrare la procedura sarà Shaina Anuncio, un tecnico del mio laboratorio.
Per iniziare, applicare un sottile strato di crema depilatoria sulla zona anteriore del torace dei topi per meno di un minuto per rimuovere la pelliccia. Utilizzare un tovagliolo di carta bagnato per rimuovere la crema e la pelliccia sciolta. Confermare la profondità dell'anestetico appropriata non rispondendo al pizzico della zampa posteriore.
Applicare unguento oftalmico su entrambi gli occhi per prevenire l'essiccazione corneale. Posizionare un topo alla volta in posizione supina sulla piattaforma riscaldata della stazione di imaging a ultrasuoni per piccoli animali con il cono del naso in posizione. Fissare il mouse sul palco con nastro adesivo medico sugli arti posteriori e anteriori.
Disinfettare la pelle del torace superiore priva di pelliccia utilizzando un applicatore di gluconato di clorexidina. Attivare la sonda lineare ad alta frequenza disponibile. Tipicamente, la sonda con la più alta risoluzione spaziale per le dimensioni dell'animale da fotografare.
Attivare la sonda toccando il pulsante corrispondente dopo la schermata di avvio. Per ottimizzare le impostazioni degli ultrasuoni per l'imaging e l'iniezione, regolare la profondità del campo visivo a una dimensione appropriata per l'animale di destinazione regolando i cursori orientati verticalmente sul lato destro dello schermo. Regola il guadagno della scala di grigi facendo scorrere il pulsante lungo la barra orizzontale nella parte inferiore dello schermo.
Quindi, regolare la zona focale al livello previsto del timo. Applicare circa un millilitro di gel per ultrasuoni sulla superficie del trasduttore mentre è in posizione verticale, appoggiato nel supporto della macchina ad ultrasuoni o nelle mani di un assistente. Per preparare un piccolo campo sterile accanto alla piattaforma riscaldata, svuotare un coperchio sterile della sonda, elastico, guanti sterili e gel per ultrasuoni sterili sul campo sterile.
Quindi, indossare i guanti sterili. Posizionare con cautela il coperchio sterile della sonda sul trasduttore a ultrasuoni e sul gel. Per mantenere la sterilità, toccare solo la copertura sterile.
Far scorrere l'elastico sterile sul coperchio della sonda per tenerlo in posizione. Posizionare da due a tre millilitri di gel per ultrasuoni sterile sul trasduttore. Posizionare verticalmente la sonda con gel ad ultrasuoni sulla parte disinfettata della parete toracica anteriore del mouse per l'imaging iniziale, mantenendo la sterilità.
Visualizza e ottimizza l'immagine ecografica come dimostrato in precedenza. Per scansionare il torace anteriore del mouse in un piano trasversale, tenere il trasduttore verticalmente e spostarlo su e giù dal collo all'addome in un movimento simile a un pennello o ampio. Con il cuore centrato nel campo visivo, spazzare leggermente il trasduttore verso il collo.
Notate le due strutture nere rotonde accoppiate su entrambi i lati della parte superiore del torace. Utilizzando la sonda ad ultrasuoni, individuare la porzione più ampia del timo, che di solito è il sito bersaglio ideale per l'iniezione. Anticipare una traiettoria orizzontale dell'ago nella posizione scelta e annotare dove si trovano i principali vasi sanguigni in questo sito.
Questi vasi devono essere evitati durante l'iniezione. I vasi sanguigni saranno strutture pulsatili ipoecogene. In caso di dubbi, attivare la modalità color Doppler toccando il pulsante colore sullo schermo per verificare il flusso all'interno dei vasi.
Tenere il trasduttore in una mano e un ago da insulina calibro 30 con 10 microlitri di iniettare nell'altra. Per iniziare il processo di iniezione, spostare il trasduttore lateralmente in modo che il timo sia decentrato nel campo visivo degli ultrasuoni. Assicurarsi che l'altro lato del campo visivo sia costituito principalmente da gel ad ultrasuoni e nient'altro.
Posizionare la punta dell'ago nel gel sotto il trasduttore e spostare lentamente l'ago fino a quando non viene visualizzato adiacente alla superficie della pelle. Durante l'imaging continuo dell'ago sotto ultrasuoni, inserire l'ago nella ghiandola del timo con una traiettoria percutanea lontano dai vasi sanguigni. Utilizzare una traiettoria orizzontale del timo incrociato per posizionare la punta dell'ago nel lobo timico controlaterale al sito di ingresso.
Una volta che la punta dell'ago si trova all'interno della porzione desiderata del timo, iniettare rapidamente il contenuto dalla siringa da 30 gauge utilizzando la visualizzazione ecografica. Per stabilizzare la siringa durante l'inserimento e l'iniezione dell'ago, tenere la siringa tra il pollice e il terzo dito e controllare lo stantuffo della siringa con l'indice. Rimuovere l'ago dopo che tutto il contenuto è stato depositato.
Nei topi giovani, l'identificazione della ghiandola del timo era semplice a causa delle grandi dimensioni della ghiandola. Era più impegnativo nei topi più anziani o immunodeficienti. Tuttavia, era ancora molto fattibile con le moderne apparecchiature ad ultrasuoni.
L'iniezione di successo è stata notata quando l'ago non ha attraversato strutture critiche, come il cuore, l'aorta o una delle vene cave inferiori. La punta dell'ago è stata visualizzata nella sua posizione target durante l'iniezione, confermando la deposizione intratimica. La posizione intratimica dell'iniezione è stata confermata utilizzando Luciferina come iniezione in topi transgenici luciferasi.
Questi sono stati valutati immediatamente con imaging a bioluminescenza, confermando la corretta posizione dell'iniezione senza sacrificare l'animale. In alternativa, Trypan Blue è stato iniettato come marcatore visivo del sito di iniezione e dell'accuratezza dell'iniezione utilizzando ex vivo con necroscopia. Il nostro gruppo ha utilizzato questa tecnica per diversi grandi studi, tra cui la ricerca sull'immunoterapia del cancro, basata sull'iniezione di cellule progenitrici geneticamente modificate e per migliorare la funzione timica nei topi immunodeficienti.
