Questo protocollo consente la valutazione locale sia dell'architettura del collagene che delle caratteristiche di guasto meccanico del tessuto fibroso della placca. Poiché sia le valutazioni strutturali che quelle meccaniche sono state eseguite sullo stesso campione di tessuto, questa tecnica consente di svelare il legame funzionale tra le valutazioni strutturali e meccaniche del tessuto. Le conoscenze ottenute con questo protocollo sulla struttura del tessuto fibroso e sulle caratteristiche di fallimento sono fondamentali per prevenire e prevedere eventi fatali clinici innescati dalla rottura della placca aterosclerotica.
Per iniziare, tagliare la placca aperta lungo l'asse longitudinale dell'arteria usando forbici chirurgiche e pinzette. Ritagliare campioni di prova rettangolari dai campioni di placca, assicurandosi che i campioni siano il più grandi possibile evitando regioni tissutali contenenti lacrime o calcificazioni. Quindi, prelevare un campione di test della placca e fissare entrambe le estremità al silicone bloccando gli aghi nel tessuto.
Inserire gli aghi nella regione del campione che sarà nei morsetti del dispositivo di prova di trazione durante la prova meccanica. Indossare occhiali di sicurezza. Utilizzare una taglierina laterale per accorciare gli aghi in modo che sporgano a meno di pochi millimetri sopra la superficie del campione per evitare che danneggino l'obiettivo del microscopio.
Riempire la capsula di Petri con PBS fino a quando il campione non è immerso. Quindi, accendere il sistema del microscopio, ruotare la chiave multifotone e aprire il software operativo del microscopio. Mettere la capsula di Petri contenente il campione di prova sotto l'obiettivo e abbassare l'obiettivo del microscopio.
Attivare la modalità Live Scan. Spostate l'obiettivo in un angolo dell'esempio utilizzando le manopole sul pannello smart e fate clic sul simbolo della posizione del contrassegno nel pannello Scansione affiancamento. Se eseguita correttamente, una griglia con tutti i riquadri selezionati per l'imaging apparirà in arancione.
Quindi, fate clic su Avvia nell'angolo inferiore destro dello schermo per creare una scansione dei riquadri dell'intera superficie campione e ottenere una panoramica della geometria del campione. Dopo la scansione dei riquadri, osservare le coordinate X e Y dell'angolo superiore sinistro del riquadro superiore sinistro nel pannello Scansione piastrelle visualizzato automaticamente. Annotare queste coordinate in un foglio di calcolo.
Nel pannello Scansione affiancamento, osservare il numero di riquadri nelle direzioni X e Y nella casella ScanField. Annotare le dimensioni della scansione dei riquadri nel foglio di calcolo. Calcola le coordinate degli altri riquadri aggiungendo o sottraendo le dimensioni del riquadro.
Dalla scansione delle tessere, selezionare le tessere da visualizzare con una seconda generazione armonica o imaging SHG. Per la selezione, evitare le tessere nei morsetti e lasciare una tessera tra ogni piastrella selezionata sia nella direzione longitudinale che in quella circonferenziale. Quindi, identifica la posizione dei riquadri da visualizzare usando le coordinate calcolate in questo foglio di calcolo.
Compila le coordinate nelle caselle designate e fai clic su Invio in modo che l'obiettivo si sposti nel riquadro destro. Attivare la modalità Live Scan. Aumentare la potenza del laser multifotone, o MP, utilizzando il cursore nel pannello superiore e le impostazioni del percorso del fascio per ottenere la massima potenza laser possibile senza sbiancamento significativo.
Quindi, regolare il guadagno del rilevatore per ottenere immagini luminose senza pixel saturi utilizzando la manopola sul pannello intelligente o facendo clic sul nome del rilevatore e sulle impostazioni del percorso del fascio e sui canali aggiuntivi. I valori tipici per il guadagno del rilevatore sono compresi tra 500 e 800 volt. Utilizzare la manopola di posizione Z sul pannello intelligente per regolare il piano di messa a fuoco.
Quindi, spostatevi nella parte superiore dell'esempio e impostate le posizioni della parte superiore dello stack Z facendo clic sulla punta della freccia nel pannello Z-stack nella scheda Acquisizione dal terzo pannello. Quindi, concentrarsi sul campione fino a quando il segnale SHG non viene più rilevato. Ancora una volta, fate clic sulla punta della freccia nel pannello Z-stack per impostare questa posizione.
Al termine, disattivare la modalità Live Scan. Nella scheda Acquisizione nel secondo pannello, mantenere la velocità di scansione a 400 hertz, impostare la media della linea su due e la risoluzione su 512x512 pixel per immagine utilizzando gli elenchi a discesa. Attiva il pulsante di scansione X bidirezionale.
Fare clic sulla dimensione z-step nel pannello Z-stack e riempire una dimensione z-step di tre micron nella casella. Fare clic su Start nell'angolo inferiore destro dello schermo per creare uno stack Z. Al termine, salvare le coordinate del riquadro nel nome del file o assegnare a ciascun riquadro il relativo numero.
Dopo l'imaging, il campione viene esposto a test meccanici. Per generare un motivo spackle, tenere l'aerografo riempito con colorante di tessuto a circa 30 centimetri di distanza dal campione di prova e spruzzarlo sulla superficie luminosa. Successivamente, per la prova di trazione uniassiale, posizionare il campione nei morsetti del tester di trazione con la direzione circonferenziale del campione allineata con la direzione di allungamento della trazione e il lato lumenale del campione rivolto verso l'alto.
Assicurarsi che la lunghezza iniziale del misuratore sia impostata in modo che il rapporto larghezza-lunghezza del nastro sia inferiore a uno. Stringere le viti delle impugnature applicando una coppia di 20 centinewton metri utilizzando un cacciavite dinamometrico. Aggiungere PBS nel bagno di riscaldamento fino a quando il campione non è immerso.
Strappare la cella di carico e iniziare a registrare le misurazioni globali della forza e dello spostamento dalla cella di carico e dall'attuatore del tester di trazione. Raddrizzare il campione applicando un pre-allungamento di 0,05 newton per eliminare il gioco nel campione. Eseguire 10 cicli di pre-condizionamento, fino al 10% di deformazione, in base alla misurazione della lunghezza del manometro da parte dell'attuatore dopo l'applicazione del pre-stiramento.
Avviare la prova di trazione uniassiale fino al completo cedimento del campione durante la registrazione di un video della deformazione del campione con la telecamera ad alta velocità. Dopo un guasto, interrompere la registrazione delle misurazioni globali della forza e dello spostamento. Apri gli Z-stack ottenuti durante la microscopia multifotonica, o MPM, con SHG nell'immagine J e crea proiezioni di massima intensità, o MIP, di ogni Z-stack.
Analizza ogni MIP con lo strumento di analisi dell'orientamento delle fibre open source basato su MATLAB per misurare l'angolo di orientamento delle singole fibre di collagene presenti nelle piastrelle. Usa un altro strumento basato su MATLAB, FibLab, per adattare una distribuzione gaussiana all'istogramma della distribuzione angolare. Dal grafico di distribuzione gaussiana, estrarre i parametri strutturali come l'angolo di fibra predominante, che è il modo della distribuzione, la deviazione standard della distribuzione dell'angolo della fibra e la frazione anisotropa.
Eseguire un'ispezione visiva sulle immagini della telecamera per identificare il fotogramma in cui si verifica l'inizio della rottura. Identificare visivamente la posizione di rottura. Esegui l'analisi della correlazione delle immagini digitali, DIC, con il software basato su MATLAB ncorr utilizzando le immagini della telecamera registrate durante il test di trazione.
Selezionate l'ultimo fotogramma prima dell'allungamento finale fino al fallimento come immagine di riferimento. Per le immagini correnti, selezionate tutte le immagini dall'inizio dell'allungamento finale fino all'ultimo fotogramma prima del fotogramma in cui si è verificato l'inizio della rottura. Selezionare la superficie campione come regione di interesse o ROI.
Escludere le aree vicine ai morsetti. Eseguite DIC impostando il raggio del sottoinsieme del parametro su 30 pixel, la spaziatura dei sottoinsiemi su tre pixel, il cutoff dell'iterazione su 50, la norma del cutoff del vettore differenza su 10 alla potenza di cinque, il raggio di deformazione su cinque e il passaggio di autopropagazione su cinque. Dall'analisi DIC con ncorr, ottenere le distribuzioni di deformazione Green-LaGrange o Euleriane del ROI.
Utilizzare queste distribuzioni di deformazione per calcolare la deformazione media di Green-LaGrange dell'intera superficie del campione di placca nell'ultimo fotogramma prima della rottura. Calcolare la deformazione Green-LaGrange nella posizione di rottura. Utilizzando i punti di riferimento naturali nel campione di prova, creare una sovrapposizione dell'immagine di riferimento e della scansione delle tessere per identificare la posizione di rottura sulla scansione delle piastrelle.
Identificare la piastrella MPM-SHG in cui si è verificata la rottura. Se la rottura non è in una piastrella scansionata con MPM-SHG, identificare la piastrella più vicina alla posizione di rottura. Ottenere i parametri strutturali trovati nella piastrella in cui si è verificata la rottura.
Qui viene mostrato un campione di placca fresco e intatto con poche o nessuna lacrima e macrocalcificazioni. I campioni di placca possono essere recuperati da aree che non includono queste lacrime e calcificazioni. L'imaging SHG e la post-elaborazione delle immagini forniscono MIP da ogni riquadro di immagine.
Un'ulteriore post-elaborazione mediante rilevamento delle fibre produce istogrammi di orientamento delle fibre da cui è possibile estrarre i parametri strutturali del collagene. Inoltre, per l'analisi visiva si ottengono mappe a colori che mostrano i parametri strutturali locali del collagene sull'intero campione di placca. Da questi campioni di prova, è stata osservata una grande variazione intracampione nei parametri strutturali del collagene.
L'inizio della rottura e la propagazione in un campione di tessuto placcato durante la prova di trazione sono dimostrati qui. L'analisi digitale della correlazione delle immagini fornisce mappe locali di deformazione tissutale, come le mappe di deformazione Green-LaGrange. Da queste mappe di ceppo, è stata osservata una grande variazione intracampionaria nei ceppi locali.
Una volta identificata la posizione di rottura nelle registrazioni della telecamera, è possibile mapparla all'immagine della telecamera di riferimento e alla scansione della piastrella microscopica. Questo fornisce la piastrella MPM-SHG in cui si è verificata la rottura e i parametri strutturali trovati in questa piastrella. Ottenere campioni di tessuto fibroso privi di calcificazioni e di dimensioni sufficientemente grandi e lavorabili per test meccanici può essere un compito impegnativo per le placche fortemente calcificate.
Una volta identificata una caratteristica meccanica o strutturale come predittore di insufficienza tissutale della placca fibrosa, un sistema di imaging in vivo che misura questa caratteristica consentirà di prevedere il rischio di rottura della placca nei pazienti.
