Abbiamo sviluppato l'emulsione Pickering stabilizzata con nanoparticelle PLGA. L'emulsione di Pickering ha migliorato l'affinità cellulare con le cellule proteiche dell'antigene, inducendo un'internalizzazione efficiente degli antigeni. Le emulsioni Pickering stabilizzate con nanoparticelle erano facili da preparare e fornire l'antigene in modo efficiente.
Inoltre, è stato utilizzato un metodo per monitorare l'affinità dell'emulsione con la cellula ed elaborare l'internalizzazione. Questo protocollo fornisce approfondimenti per la progettazione di nuove formulazioni con elevata efficienza cellulare e internalizzazione efficiente dell'antigene, che forniscono una piattaforma per lo sviluppo di vaccini efficienti. Per iniziare, aggiungere 100 milligrammi di acido polilattico-co-glicolico a 10 millilitri di acetone ed etanolo in un rapporto di quattro a uno per fungere da fase oleosa.
Porre 20 millilitri di soluzione acquosa di PVA sotto la cappa aspirante e mescolare magneticamente a 400 rotazioni al minuto. Aggiungere cinque millilitri di fase oleosa nella soluzione PVA goccia a goccia utilizzando una pompa a siringa. Quindi mescolare la miscela nella cappa aspirante fino a quando i solventi organici evaporano completamente.
Dopo la volatilizzazione dei solventi organici, centrifugare la miscela a 15.000 G.Lavare tre o più volte fino a quando l'acqua di lavaggio finale è limpida e trasparente. Risospendere le nanoparticelle di PLGA lavate in due millilitri di acqua deionizzata e congelare la miscela a 80 gradi Celsius per 24 ore. Per caratterizzare le dimensioni e il potenziale zeta delle nanoparticelle di PLGA, aggiungere 10 microlitri di nanoparticelle PLGA in un millilitro di acqua deionizzata per ottenere una soluzione di diluente e trasferire la soluzione di diluente in una cella DTS1070.
Accendere il computer e l'analizzatore dinamico di diffusione della luce. Quindi posizionare la cella DTS1070 nel sistema DLS. Fare clic sul software Zetasizer e creare un nuovo file di misurazione per impostare la procedura di determinazione.
Quindi avviare la procedura di determinazione per ottenere la dimensione delle particelle e la distribuzione del potenziale zeta. Per preparare l'emulsione Pickering stabilizzata con nanoparticelle PLGA, o PNPE, aggiungere nanoparticelle di PLGA liofilizzate all'acqua deionizzata ad una concentrazione di quattro milligrammi per millilitro e quindi aggiungere squalano come fase oleosa. Preparare PNPE tramite sonicazione one-step per cinque minuti a 100 watt in un sonicatore a bagnomaria.
Diluire 20 microlitri di PNPE e un millilitro di acqua deionizzata. Far cadere 20 microlitri di emulsione sul vetrino. Osservare la morfologia e l'omogeneità dell'emulsione utilizzando la microscopia ottica a 40 volte l'ingrandimento e ottenere fotografie.
Accendere lo spin coater premendo il pulsante di accensione. Premere il pulsante di controllo e impostare il tempo e la velocità del rivestimento. Collegare il tubo di azoto allo spin coater e regolare il frazionamento della bombola del gas a 0,4 kilopascal.
Posizionare il chip pulito sulla ventosa dello spin coater. Aggiungere 100 microlitri di poli-l-lisina a goccia al centro del sensore di biossido di silicio e chiudere il coperchio superiore dello spin coater. Premere il pulsante di avvio per iniziare a rivestire il campione e arrestare la macchina al termine.
Spegnere la pompa del vuoto, spegnere i pulsanti di accensione e controllo e rimuovere il sensore di biossido di silicio modificato con poli-l-lisina. Per determinare l'adesione delle vescicole extracellulari biomimetiche a PNPE, accendere il computer, l'unità elettronica e la pompa peristaltica e attivare il controllo della temperatura in basso a destra nel software per garantire che la temperatura impostata sia di circa un grado Celsius al di sotto della temperatura ambiente. Posizionare i sensori di biossido di silicio modificato con poli-l-lisina nella cella di flusso secondo le istruzioni per l'uso e collegare la linea di misura tra la cella di flusso e la pompa di flusso.
Posizionare la cella di flusso all'interno del sistema del modulo di flusso. Fare clic sulla barra degli strumenti Acquisizione e selezionare Setup Measurement per cercare 1, 3, 5, 7, 9 e 11 ottave del chip nel canale utilizzato. Per correggere la linea di base, fare clic su Avvia misurazione per consentire all'aria di entrare nel modulo di flusso fino a quando la linea di base dell'aria non è liscia.
Dopo aver fatto scorrere acqua deionizzata per 10-15 minuti per consentire nuovamente l'equilibrio di base della soluzione, pompare la soluzione PNPE preparata nel modulo di flusso a una portata di 50 microlitri al minuto per ottenere l'adsorbimento all'equilibrio sul sensore di biossido di silicio. Pompare la soluzione di vescicola extracellulare biomimetica preparata nel modulo di flusso a una portata di 50 microlitri al minuto per tracciare il processo di adesione bEV alla superficie PNPE. Incubare le cellule dendritiche del midollo osseo con 1640 mezzi completi per sette giorni e poi seminarle in piccole piastre laser confocali a 1 volte 10 al 6 per pozzetto durante la notte a 37 gradi Celsius e un incubatore di anidride carbonica al 5%.
Mescolare 0,5 millilitri di cianina 5 marcata ovalbumina, con 0,5 millilitri di PNPE per un'ora e rimuovere l'antigene fluidico mediante centrifugazione a 5.000 G per 20 minuti per sviluppare la formulazione del vaccino. Dopo la risospensione con 200 microlitri di acqua deionizzata, aggiungere 10 microlitri della formulazione nelle piccole piastre laser confocali sotto un banco super pulito e co-coltura con cellule dendritiche del midollo osseo per sei ore. Dopo aver rimosso il fluido di coltura dalle cellule, lavarle due volte con soluzione salina tamponata fosfato preriscaldata.
Fissare le cellule con una soluzione di formaldeide al 4% e PBS per 10 minuti a temperatura ambiente. Lavare le celle con PBS due o tre volte a temperatura ambiente per 10 minuti ciascuna. Permeabilizzare le cellule con 100 microlitri di soluzione Triton X-100 allo 0,5% per cinque minuti a temperatura ambiente.
Dopo aver lavato nuovamente le cellule con PBS, coprire le cellule sul piatto inferiore di vetro delle piccole piastre laser confocali con 200 microlitri di soluzione di lavoro di falloidina coniugata con isotiocianato di fluoresceina e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente al buio. Dopo aver lavato le cellule con PBS tre volte per cinque minuti ciascuna, conservare i nuclei con 200 microlitri di soluzione DAPI per circa 30 secondi. Per l'analisi delle immagini, accendere l'hardware del microscopio confocale in sequenza, includendo laser, confocale, microscopio e computer.
Fare clic sul software e selezionare Nikon Confocal per accedere al sistema di test. Nel sistema di microscopio confocale, accendere le varie unità nell'ordine indicato. Innanzitutto, impostare i canali FITC, DAPI e Cy5 e regolare l'HV e l'offset corrispondenti.
Quindi, dopo aver selezionato la lente dell'olio 100 volte e messo una goccia di olio di cedro sulla parte superiore, posizionare i piccoli piatti laser confocali contenenti cellule dendritiche del midollo osseo colorate sullo stadio del microscopio. Fare clic sul pulsante di scansione. Al microscopio a fluorescenza, individuare le cellule di interesse spostando l'asse x, l'asse y e l'asse z.
Regola l'intensità del laser, le dimensioni dell'immagine e altri parametri per consentire la scansione di immagini confocali di alta qualità. Infine, fai clic sul pulsante Cattura e salva le immagini. L'adesione delle vescicole extracellulari biomimetiche a PNPE è stata monitorata utilizzando QCM-D.
Un'immediata diminuzione della frequenza, ha indicato una rapida adesione delle vescicole extracellulari biomimetiche alla PNPE dopo l'incontro. Inoltre, il delta F è diminuito con l'aumentare della concentrazione di vescicole extracellulari biomimetiche, riflettendo un effetto dipendente dalla concentrazione. Le microparticelle di PLGA e la nano emulsione stabilizzata con tensioattivo erano debolmente legate alle vescicole extracellulari biomimetiche, anche ad alta concentrazione di 80 microgrammi per millilitro, che probabilmente risultava da una mancanza di siti di contatto con le cellule immunitarie.
Il segnale fluorescente dell'ovalbumina cianina-5 ha indicato che la quantità totale di antigene internalizzato nelle cellule è significativamente più alta nel gruppo trattato con PNPE rispetto a quella nel gruppo trattato con microparticelle PLGA e nano emulsione stabilizzata con tensioattivi. L'analisi quantitativa dell'assorbimento cellulare ha mostrato un'intensità relativa significativamente più elevata di fluorescenza e cellule dendritiche del midollo osseo trattate con PNPE rispetto a quelle trattate con microparticelle PLGA e nano emulsione stabilizzata con tensioattivi. I risultati ottenuti hanno dimostrato che il PNPE ha promosso l'internalizzazione dell'antigene e ha effettivamente consegnato l'antigene intracellulare.
Per ottenere un'emulsione omogenea, la miscela deve essere continuamente agitata durante la sonicazione.
