Lo scopo generale di questo metodo è quello di analizzare l'effetto del trattamento dello stress sulle cellule batteriche, sia a livello di singola cellula che a livello di popolazione. Fornisce una visione globale dell'effetto dello stress su diversi aspetti della crescita batterica, tra cui la vitalità cellulare, la morfologia e il contenuto di DNA. Consente inoltre di caratterizzare il recupero della popolazione.
Questo metodo potrebbe essere utilizzato nell'industria farmaceutica per migliorare l'attività di una nuova molecola antimicrobica e apprezzarne l'impatto sulla vitalità e sulla crescita dei batteri. Il trattamento che induce stress ha un'inefficienza, come la dose e il tempo dipendente. Può essere necessario eseguire test preliminari per determinare la dose ottimale e la durata del trattamento prima di iniziare questo protocollo.
La dimostrazione visiva di questo metodo consente di immaginare dettagli importanti di ogni fase critica e come eseguirli correttamente. Per iniziare, inoculare cinque millilitri di MOPS EZ Rich Defined Medium con una singola colonia di E.Coli MG1655 HU-PAmCherry e crescere a 37 gradi Celsius con scuotimento a 140 rotazioni al minuto durante la notte. La mattina seguente, estrarre 100 microlitri del campione e diluirlo con 900 microlitri di mezzo per misurare la densità ottica a 600 nanometri.
Quindi, diluire la coltura in una provetta contenente mezzo fresco fino a un OD600 nanometri di 0,01. Incubare la provetta inoculata a 37 gradi Celsius con scuotimento a 140 RPM fino a quando la densità ottica raggiunge 0,2, corrispondente alla fase esponenziale completa in mezzo ricco. Quindi, aliquota i campioni di coltura per l'imaging di microscopia time-lapse, il saggio di diluizione e placcatura, l'analisi della citometria del flusso e l'imaging istantaneo della microscopia.
Esporre i restanti 4,4 millilitri di coltura cellulare nella provetta a un trattamento specifico di stress. Ad esempio, 4,4 microlitri di cefalossina a cinque microgrammi per millilitro e incubano a 37 gradi Celsius con scuotimento a 140 giri/min. Preparare dieci volte le diluizioni seriali, fino a 10 alla settima meno, dei 200 microlitri del campione di coltura in mezzo fresco.
Mescolare tra ogni diluizione con vortici molto delicati o invertendo il tubo. Piastra 100 microlitri dell'appropriata diluizione su piastre di agarosio LB non selezionate e incubare durante la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, conta il numero di colonie per determinare la concentrazione di cellule vitali in ogni campione di coltura.
Tracciare la CFU per millilitro in funzione del tempo per le colture cellulari non trattate e trattate. Misurare l'OD600 della coltura su uno spettrofotometro. Diluire il campione di coltura con mezzo fresco a quattro gradi Celsius per ottenere un campione con OD600 a 0,06, corrispondente a circa 15.000 cellule per microlitro.
Per la colorazione del DNA, mescolare il campione batterico diluito con una soluzione di 10 microgrammi per millilitro di colorante fluorescente di DNA alla razione di volume da uno a uno e incubare al buio per 15 minuti. Prima dell'iniezione del campione, mescolare il campione con vortici molto delicati o invertendo il tubo. Passare il campione nel citometro di flusso a una portata di circa 120.000 celle al minuto.
Acquisire luce diffusa in avanti e diffusa lateralmente, nonché il segnale fluorescente di colorante/fluorescente dna con le impostazioni appropriate. Tracciare l'istogramma a densità cellulare dispersa in avanti per rappresentare la distribuzione delle dimensioni delle cellule e tracciare l'istogramma di densità del colorante fluorescente /della densità della cellula del segnale fluorescente del DNA per rappresentare il contenuto di DNA nella popolazione cellulare. In primo luogo, preriscaldare la camera del microscopio termostato a 37 gradi Celsius per stabilizzare la temperatura.
Preparare le diapositive montate sull'agarosio come descritto nel manoscritto. Posizionare la diapositiva sullo stadio del microscopio ed eseguire l'acquisizione di immagini utilizzando la luce trasmessa con un obiettivo di contrasto facciale e con eccitazione della sorgente luminosa a 560 nanometri per mCherry. Selezionare i campi di visualizzazione che contengono celle isolate per facilitare il rilevamento automatico delle celle durante l'analisi delle immagini.
Assicurarsi che almeno 300 celle siano immagini per consentire una solida analisi statistica della popolazione cellulare. In primo luogo, rimuovere la soluzione di conservazione dalla piastra microfluidico e sostituirla con un mezzo fresco preriscaldato a 37 gradi Celsius come descritto nella Guida dell'utente del software microfluidico. Attaccare la piastra microfluidico al sistema di collettori.
E nel software microfluidico, fare clic sul pulsante Di tenuta per sigillare la piastra al sistema di collettori. Successivamente, fai clic sul pulsante Priming. Posizionare la piastra microfluidica con il sistema di collettori sullo stadio del microscopio e preriscaldare a 37 gradi Celsius per due ore per evitare la dilatazione della camera microfluidica.
Sigillare la piastra microfluidico sul sistema microfluidico facendo clic sul pulsante Sigilla. Sostituire il mezzo da ben otto con 150 microlitri di campione di coltura e sostituire il mezzo da ben uno a cinque con il mezzo desiderato, con o senza il reagente che induce stress. Sigillare la piastra microfluidica e posizionarla sullo stadio del microscopio.
Nel software microfluidico eseguire la procedura di caricamento delle celle. Verificare che il caricamento delle cellule sia soddisfacente guardando al microscopio in luce trasmessa. Concentrati attentamente in modalità luce trasmessa e seleziona diversi campi di vista che mostrano batteri isolati e non sono sovraffollati, da 10 a 20 celle per 100 microlitri quadrati.
Nel software microfluidico, fare clic sul pulsante Esegui sequenza personalizzata, quindi programmare l'iniezione del mezzo che induce stress durante 10 minuti a due PSI, seguito da iniezione in una PSI per la durata voluta del trattamento di stress. Eseguire l'imaging della microscopia in modalità time-lapse con un fotogramma ogni 10 minuti, utilizzando il contrasto di fase nella luce trasmessa e una sorgente luminosa di eccitazione di 560 nanometri per il segnale mCherry, se necessario. Inizia contemporaneamente l'acquisizione microscopica dell'immagine e il protocollo di iniezione microfluidico.
Aprire il software Fiji e il plug-in MicrobeJ. Per l'analisi delle istantanee, rilascia tutte le immagini corrispondenti a una diapositiva del microscopio nella barra di caricamento MicrobeJ per concatenare le immagini e salvare il file degli stack di immagini ottenuti. Per i dati time-lapse, basta rilasciare lo stack di immagini nella barra di caricamento di MicrobeJ.
Eseguire il rilevamento automatico dei contorni della cellula in base alla segmentazione dell'immagine di contrasto di fase ed eseguire il rilevamento dei nucleoidi in base alla segmentazione del segnale fluorescente del DNA macchiato. Verificare visivamente l'accuratezza del rilevamento delle celle e, se necessario, utilizzare lo strumento di modifica MicrobeJ per la correzione. Salvare il file dei risultati ottenuto.
Fate clic sull'icona ResultJ per completare l'analisi e ottenere la finestra ResultJ. Vengono generati molti tipi diversi di grafici di output. Tracciare gli istogrammi normalizzati di forma o lunghezza cellulare e numero nucleoide medio per cella.
Questo studio ha analizzato il comportamento delle cellule Escherichia coli K-12 durante l'esposizione transitoria alla cefalesina, un antibiotico che inibisce specificamente la divisione cellulare. Le colture cellulari che crescono in presenza di cefalossina hanno mostrato un OD600 simile all'aumento delle colture non stressate. La concentrazione di cellule vitali non è aumentato quando era presente la cefalossina.
Le cellule hanno ricominciato a dividersi quando la cefalossina è stata rimossa e alla fine hanno raggiunto una concentrazione equivalente alla coltura non stressata dopo due ore. Diverse sollecitazioni hanno portato a diversi disaccoppiamento delle curve OD e CFU per millilitro, a seconda dell'effetto indotto. L'esposizione alla cefalossina ha provocato un parallelo aumento delle dimensioni delle cellule e del contenuto di DNA.
Quando la cefalesina è stata rimossa, le dimensioni delle cellule della popolazione e il contenuto di DNA sono gradualmente diminuiti e sono diventati simili alla popolazione non stressata dopo due ore. La cefalossina provocò la formazione di cellule lunghe con larghezza cellulare normale, quindi nessun setto di divisione. L'analisi quantitativa delle immagini ha confermato la dimensione delle cellule e l'aumento del contenuto di DNA.
Le immagini time-lapse confermano che l'allungamento cellulare e la replicazione cromosoma e la segregazione non sono stati inibiti dall'esposizione alla cefalesina. L'analisi del lignaggio cellulare filamentoso ha mostrato che la divisione cellulare è ricominciata circa 20 minuti dopo aver lavato via il farmaco. È fondamentale assicurarsi che la popolazione batterica sia in piena crescita esponenziale prima di indurre trattamenti antiduttivi.
Il trattamento che induce stress utilizzato per questi approcci potrebbe essere pericoloso per il composto sperimentale, come il composto genotossico. Quindi maneggia il composto con attenzione e indossa guanto, maschera, maschera e camice da laboratorio.
