Il nostro protocollo presenta un metodo altamente efficiente e facilmente riproducibile per quantificare il DNA a singolo filamento, che è un marker dello stress di replicazione in una varietà di linee cellulari. Inoltre, la sua semplicità consente applicazioni e schermi ad alta produttività. In particolare, questo metodo consente una rapida quantificazione di uno stress di replicazione, un segno distintivo di diversi tumori ovarici.
È anche suscettibile di un software di analisi automatica host, aumentando ulteriormente l'efficienza. Il DNA a singolo filamento viene ora attivamente considerato come biomarcatore per la risposta alla chemioterapia mirata ai percorsi di riparazione del DNA. Quindi, questo metodo è altamente applicabile in quello scenario.
Lo stress di replicazione esiste al di là dei contesti di cancro ovarico o dei tumori carenti di BRCA1, BRCA2. E quindi, questo metodo può essere applicato a una vasta gamma di altri tipi di cellule o contesti di malattia. Per iniziare, realizzare vetrine di copertura rivestite in polilisina aggiungendo vetrine di copertura autoclavate da 12 millimetri di diametro e soluzione di polilisina a un tubo conico da 50 millilitri e posizionare su un bilanciere per 15 minuti.
Aspirare la soluzione su una cappa di coltura tissutale. Lavare i vetrini di copertura aggiungendo acqua sterile e riposizionare il tubo contenente i vetrini di copertura sul bilanciere per cinque minuti. Dopo aver lavato il coperchio scivola tre volte, aspirare l'acqua dal tubo e distribuire i foglietti di copertura su un piatto sterile.
Aspirare l'acqua rimanente e lasciarli asciugare nella cappa di coltura tissutale per un'ora o fino a quando non rimangono goccioline d'acqua. Una volta asciutto, sigillare il piatto con Parafilm e posizionarlo a 4 gradi Celsius. Per evitare il distacco delle cellule dai vetrini di copertura durante la fase di pre-estrazione, posizionare un vetrino di copertura rivestito di polilisina in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti.
Una volta che le celle OVCAR3 raggiungono il 70-80% di confluenza, aspirare il mezzo dalla piastra e lavare le cellule con 5-7 millilitri di PBS. Aspirare il PBS dalla piastra. Dopo aver aspirato il PBS, aggiungere 1 millilitro di tripsina allo 0,25% e posizionare il piatto nell'incubatore a 37 gradi Celsius per 8-10 minuti o fino a quando le cellule non si sollevano dal fondo della piastra.
Raccogliere le celle con 5-10 millilitri di mezzo e aggiungere la sospensione cellulare a un tubo conico. Contare le cellule manualmente con un emocitometro utilizzando procedure standard. Quindi, diluire la sospensione cellulare e ottenere un numero che produrrà dal 70 all'80% di confluenza dopo tre popolazioni.
Aggiungere 1 millilitro di sospensione cellulare su vetrini di copertura in polilisina posti nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti e far crescere le cellule nel terreno di coltura in condizioni standard. Dopo un raddoppio della popolazione, aspirare il mezzo esistente dalla piastra e pulsare le cellule con IdU 10 micromolari per i due successivi raddoppi della popolazione. Per raccogliere le cellule, sostituire il terreno con ghiaccio 0,5% PBSTx ghiacciato su ghiaccio per cinque minuti.
Per la fissazione delle cellule, aspirare PBSTx e incubare le cellule per 15 minuti con paraformaldeide al 3% a temperatura ambiente. Dopo tre o quattro lavaggi con PBS, mantenere le celle fisse a 4 gradi Celsius fino a un ulteriore utilizzo. Dopo la fissazione, permeabilizzare le cellule utilizzando lo 0,5% di PBSTx sul ghiaccio per cinque minuti, assicurandosi di coprire l'intero vetrino di copertura.
Dopo aver lavato le celle tre o quattro volte con 1 millilitro di 0,2% PBST a temperatura ambiente, aspirare il PBST e bloccare i campioni utilizzando 5% BSA fatto in PBS per 30 minuti a temperatura ambiente. Per l'immunocolorazione, preparare una camera unificata mettendo un tovagliolo di carta bagnato su un Tupperware a fondo piatto. Coprire il coperchio della piastra a 24 pozzetti con Parafilm.
Posizionarlo nella camera umidificata e posare i vetrini di copertura sul coperchio della piastra. Aggiungere 60 microlitri di anticorpo primario diluito anti-BrdU sul topo sulla parte superiore del vetrino. In alternativa, per ridurre l'essiccazione dell'anticorpo e utilizzare meno volume, posizionare una goccia di anticorpo diluito sul parafilm e capovolgere la linguetta di copertura su di esso.
Quindi incubare per un'ora a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, aspirare l'anticorpo primario. Riportare i vetrini di copertura su una piastra a 24 pozzetti e lavarli con lo 0,2% di PBST quattro volte.
Aggiungere anticorpi secondari diluiti sul vetrino di copertina come dimostrato in precedenza e incubare per un'ora al buio a temperatura ambiente. Etichettare un vetrino da microscopio e montare il vetrino di copertura sui vetrini con supporto di montaggio DAPI. Conservare i vetrini al buio a temperatura ambiente per 24 ore se il mezzo di montaggio deve essere polimerizzato o indurito.
I nuclei derivati dalle cellule non trattate e trattate con idrossiurea millimolare 0,5 sono stati colorati e identificabili nei canali DAPI e IdU. L'analisi di queste immagini consiste nel quantificare il numero di focolai in ciascun nucleo. Il numero di fuochi è proporzionale al grado di stress di replicazione.
È importante considerare il tempo di raddoppio della linea cellulare scelta poiché il tempo di pulsazione IdU può variare per periodi di raddoppio più o meno lunghi. In alternativa, possiamo sondare le cellule per la proteina di replicazione A per confermare i risultati e valutare varie risposte allo stress di replicazione nelle cellule. Questa tecnica viene utilizzata per molte linee cellulari in tandem con qualsiasi agente che induce danni al DNA per esaminare l'accumulo di DNA a singolo sforzo.
Pertanto, questo metodo è ampiamente accessibile e applicabile.
