L'analisi delle fibre del DNA ci permette di capire come i nanomateriali influenzano il DNA a livello molecolare singolo. E queste informazioni consentiranno lo sviluppo di strategie che ridurranno la nanotossicità. Questa tecnica ci consente di comprendere le dinamiche del DNA e come viene influenzato quando le cellule o i tessuti sono esposti ad agenti dannosi per il DNA, esogeni o endogeni, e possiamo esaminare la replicazione del DNA, la riparazione del DNA e la dinamica della cromatina. Lo studio delle dinamiche di replicazione del DNA e del meccanismo di riparazione aiuterà a sviluppare strategie che miglioreranno l'efficacia del materiale terapeutico o ridurranno l'effetto off-target della nanomedicina.
Quello che vogliamo davvero che la gente sappia su questa tecnica è che sono le diverse cose che possiamo fare o che una persona può fare. Uno è capire come i nuovi agenti chemioterapici possono avere un impatto sulla salute di una cellula, per vedere se è possibile ucciderli più velocemente o in modo più efficiente. La prossima cosa è pensare a quando aggiungi un agente, diciamo che è un nuovo agente terapeutico o farmaceutico, vuoi sapere se farà male a una persona prima di darglielo.
Quindi, quindi, puoi semplicemente dare l'agente alle cellule o ai sistemi modello e vedere se danneggia le cellule o il sistema modello, e se sì, quanto? La prossima cosa è guardare, stiamo sviluppando tutti questi nuovi nanofarmaci e vogliamo assicurarci che quei nanofarmaci non danneggino una persona o il luogo in cui stiamo iniettando la nanomedicina. L'ultima cosa è che a volte vuoi sapere come una proteina influisce sulla replicazione del DNA, sulla riparazione del DNA o sulla dinamica della cromatina e possiamo usare questa tecnica per essere in grado di farlo.
Questo è Shirali Patel, uno studente di ricerca di master in biotecnologia medica nel mio laboratorio, dimostrerà la procedura. Iniziare la preparazione del saggio delle fibre rimuovendo il terreno dal 75% all'80% delle cellule macrofagiche RAW 264,5 confluenti e dividendolo in due metà. Riservare una metà per l'impulso cloro-iododeossiuridina o la riserva cloro-iododeossiuridina e aggiungere cinque microlitri di iododeossiuridina all'altra metà, facendo 50 micromoli come concentrazione finale.
Dopo la miscelazione, aggiungere il mezzo contenente iododeossiuridina alle piastre e posizionare le cellule nell'incubatore per 20 minuti. Preriscaldare il mezzo di riserva cloro-iododeossiuridina a 37 gradi Celsius e aggiungere cloro-iododeossiuridina a questo mezzo prima dell'impulso cloro-iododeossiuridina. Dopo 20 minuti, aspirare la miscela media di iododeossiuridina dal matraccio cellulare macrofagico RAW 264.5.
Lavare delicatamente le celle con 500 microlitri di PBS, con pH 7,4 pH, e ruotare la piastra prima di scartare il PBS. Trattare le cellule con varie concentrazioni di nanoparticelle di ossido di grafene in 500 microlitri del mezzo e incubare per 30 minuti. Dopo l'incubazione, aspirare la miscela del mezzo di trattamento e lavare delicatamente le cellule con 500 microlitri di PBS ruotando delicatamente la piastra prima di scartare il PBS.
Quindi, aggiungere cinque microlitri di cloro-iododeossiuridina al mezzo di riserva cloro-iododeossiuridina e coprire le cellule con il mezzo di riserva cloro-iododeossiuridina. Per l'impulso cloro-iododeossiuridina, posizionare le cellule nell'incubatore per 20 minuti. Dopo un lavaggio PBS, raschiare via le cellule per tre o quattro minuti, quindi aggiungere cinque millilitri di mezzo alla piastra e raccogliere le cellule.
Centrifugare le cellule raccolte a 264G per quattro minuti. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in un millilitro di PBS ghiacciato. Per preparare le fibre del DNA, etichettare i vetrini con la condizione sperimentale e la data, usando una matita.
Aspirare due microlitri di celle in una pipetta e tenere la pipetta con un angolo di circa 45 gradi. Quindi posizionare la pipetta circa un centimetro sotto l'etichetta del vetrino e spostare la pipetta orizzontalmente verso l'etichetta del vetrino con un lento rilascio della soluzione cellulare. Una volta che la soluzione evapora e appare appiccicosa e appiccicosa, sovrapporre ogni linea di cellule con 15 microlitri di tampone di lisi senza lasciare che la punta della pipetta tocchi il vetrino.
Quindi inclinare il vetrino con un angolo di 25 gradi e lasciare asciugare il DNA all'aria per un minimo di quattro ore. Il primo giorno, fissare le fibre di DNA immergendo i vetrini in acido acetico metanolo per due minuti. Il secondo giorno, posizionare i vetrini in un portavetrini e incubarli a 20 gradi Celsius per un minimo di 24 ore.
Per denaturare il DNA, preparare una camera umidificata e posizionare con cura i vetrini in un barattolo Coplin contenente acqua deionizzata, o DI, assicurandosi che le superfici rivestite non tocchino le pareti del barattolo. Dopo 20 secondi di incubazione, versare l'acqua. Aggiungere acido cloridrico 2,5 molari al barattolo Coplin, coprendo tutti i vetrini.
Dopo 80 minuti di incubazione, somministrare un lavaggio con PBS più 0,1% Tween, seguito da due lavaggi con PBS per tre minuti ciascuno a temperatura ambiente. Per l'immunocolorazione, posizionare i vetrini nella camera umidificata e bloccarli usando il 5% di albumina sierica bovina, o BSA, in PBS per 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi coprire le diapositive con un foglio di plastica trasparente.
Dopo il blocco, rimuovere il vetrino di copertura e aggiungere 100 microlitri della soluzione anticorpale primaria lungo la lunghezza del vetrino. Aggiungi un nuovo foglietto di plastica e attendi due ore. Dopo due ore, eliminare la soluzione anticorpale e sciacquare i vetrini in un barattolo Coplin riempito di PBS due volte.
Bloccare nuovamente i vetrini aggiungendo 200 microlitri di BSA al 5% lungo il vetrino. Aggiungere un vetrino di plastica e incubare per 15 minuti. Dopo aver tolto il vetrino di copertura e rimosso il BSA in eccesso con un tovagliolo di carta, aggiungere 100 microlitri della soluzione anticorpale secondaria lungo la lunghezza del vetrino e posizionare un nuovo vetrino di plastica.
Dopo un'ora, rimuovere il vetrino di copertura, eliminare il BSA in eccesso su un tovagliolo di carta e lavare i vetrini due volte in PBS. Aggiungere 100 microlitri della soluzione anticorpale terziaria lungo la lunghezza del vetrino e posizionare un nuovo vetrino di plastica. Ancora una volta, aggiungere 200 microlitri di 5% BSA lungo ogni vetrino e incubare per 15 minuti.
Dopo tre lavaggi con PBS, rimuovere il PBS in eccesso e lasciarli asciugare completamente. Una volta asciutto, aggiungere il supporto di montaggio sulla slitta e posizionare le diapositive di copertura in vetro senza consentire la formazione di bolle. Visualizza le fibre di DNA immunocolorate utilizzando un microscopio immunofluorescente dotato di una fotocamera, un obiettivo 60x e set di filtri appropriati per rilevare i coloranti Alexa Fluor 488 e 594.
La variazione nei modelli di replicazione dopo l'esposizione a lungo termine ai nanomateriali è stata determinata confrontando i modelli di replicazione delle cellule prima e dopo l'esposizione alle nanoparticelle di iododeossiuridina e cloro-iododeossiuridina. L'analisi delle fibre del DNA e le immagini di interpretazione hanno rivelato un modello per le cellule dei macrofagi di controllo e il DNA macrofagico trattato con grafene-ossido-nanoparticelle. La variazione è stata osservata nel modello degli intermedi di replicazione, mostrando un aumento di nuove origini su una regione diversa della stessa condizione.
I dati conclusivi delle fibre sono stati ottenuti dividendo l'area totale della diapositiva in cinque-sei regioni e scattando più immagini da ciascuna regione. La selezione di circa 500 intermedi da più vetrini o condizioni era ideale per studiare la variazione delle dinamiche di replicazione del DNA. L'analisi ha anche indicato un aumento delle tracce solo rosse, indicando determinazioni e una diminuzione delle origini appena cotte nelle cellule trattate con ossido di grafene rispetto al controllo.
La qualità della diffusione della fibra di DNA dipende da quanto bene le fibre si diffondono l'una dall'altra e che non si sovrappongono. Una volta che le fibre sono state distribuite e IdU e CldU sono stati colorati, è estremamente importante trovare le fibre del DNA. Una delle cose che puoi fare dopo aver creato le fibre del DNA è, uno, puoi guardare come la dinamica di replicazione è influenzata.
Due, puoi guardare dove si trova il danno al DNA rispetto alle tracce di replicazione del DNA. E l'ultima cosa è che se si usano le sonde FISH, si possono effettivamente osservare regioni specifiche e come sono influenzate da quel danno al DNA. Questa tecnica apre la strada allo sviluppo di farmaci chemioterapici, alla progettazione di farmaci e alla comprensione di come la replicazione del DNA è influenzata da vari tipi di proteine.
