La vena safena viene improvvisamente esposta a condizioni arteriose dopo un intervento chirurgico di bypass coronarico. Comprendere la sua risposta di adattamento allo stress meccanico può aiutare a progettare strumenti terapeutici per prevenire il fallimento dell'innesto venoso. Questo protocollo di isolamento delle cellule endoteliali è molto semplice e richiede solo l'incubazione con collagenasi.
Con una manipolazione minima dei vasi, ciò si traduce in una ridotta contaminazione con cellule muscolari lisce e fibroblasti. Il protocollo per isolare le SVEC umane e coltivarle sotto sforzo di taglio e allungamento ciclico è essenziale per comprendere il contributo delle forze meccaniche nella disfunzione delle cellule endoteliali associate al fallimento dell'innesto di vena safena. La precedente coltura di cellule endoteliali è molto esigente in termini di integratori di supporti cellulari.
È obbligatorio aggiungere fattori di crescita per isolare con successo una cultura, le SVEC umane. Per isolare le cellule endoteliali primarie della vena safena umana o le SVEC umane, raccogliere almeno un segmento di vena safena lungo almeno due-tre centimetri. Lavorando sotto una cappa a flusso laminare sterile, trasferire il segmento di vena in una capsula di Petri riempita con PBS preriscaldato.
Per rimuovere tutto il sangue dall'interno del lume, inserire una punta di pipetta attaccata a una pipetta e riempita con PBS in un'estremità della vena e sciacquarla delicatamente. Sciacquare fino a quando il flusso di lavaggio diventa completamente chiaro. Quindi chiudere un'estremità della vena con una sutura di cotone sterile.
Riempire con cura la nave con una soluzione di collagenasi di tipo 2 da un milligrammo per millilitro e chiudere l'altra estremità della nave con una sutura di cotone. Incubare il recipiente con una soluzione di collagenasi in un'atmosfera umidificata di anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius per un'ora. Quindi tagliare un'estremità della nave su un tubo da 15 millilitri per raccogliere la soluzione di collagenasi prima di tagliare l'altra estremità.
Lavare la superficie luminale con uno o due millilitri di PBS per raccogliere tutte le cellule endoteliali distaccate all'interno del tubo con collagenasi. Centrifugare il tubo a 400G a temperatura ambiente per cinque minuti. Dopo aver rimosso il surnatante, risospendere il pellet cellulare in tre o quattro millilitri di mezzo cellulare endoteliale completo contenente un'ulteriore soluzione di eparina.
Placcare le cellule in un piatto di coltura cellulare da 60 millimetri pre-rivestito con gelatina al 3% di peso per volume. Incubare le cellule in atmosfera umidificata per quattro giorni senza cambiare il mezzo. Successivamente, cambiare il mezzo a giorni alterni senza aggiungere l'integrazione di eparina.
Esaminare la piastra al microscopio per assicurarsi che i globuli rossi siano stati rimossi. Dopo uno o quattro giorni dall'estrazione, a seconda delle dimensioni e del diametro del segmento venoso, visualizzare le SVEC umane mediante microscopia a contrasto di fase per valutare il grado di confluenza e la loro morfologia del ciottolo. Continuare a cambiare il supporto ogni due giorni fino a quando le celle raggiungono il 70% all'80% di confluenza.
Rivestire il vetrino della camera di flusso con gelatina allo 0,1% di peso per volume e incubare per almeno 30 minuti a 37 gradi Celsius. Per equilibrare l'unità fluidica e il set di perfusione sterile con serbatoi da 10 millimetri, incubarli durante la notte in un'atmosfera umidificata. Per l'esperimento di sforzo di taglio, seminare 200.000 cellule endoteliali sospese in 100 microlitri di terreno di coltura nel vetrino della camera di flusso rivestito di gelatina.
Per attaccare le cellule alla superficie della coltura, incubare le cellule per quattro ore. Posizionare il set di perfusione sull'unità fluidica. Riempire i serbatoi e il set di perfusione con circa 12 millilitri di mezzo cellulare endoteliale completo preriscaldato.
Rimuovere le bolle d'aria dal set di perfusione per equilibrare il livello di entrambi i serbatoi a cinque millilitri. Posizionare l'unità fluidica sul set di perfusione montato senza la slitta della camera nell'incubatore e collegare il suo cavo elettrico alla pompa regolata dal computer. Eseguendo il protocollo predefinito nel software di controllo della pompa, rimuovere tutte le bolle d'aria dai serbatoi e dal set di perfusione.
Prendere l'unità fluidica con la perfusione montata impostata sulla cappa a flusso laminare e fissare i vetrini aventi un monostrato a cella di confluenza. Dopo aver posizionato l'intera unità con le guide nell'incubatore, collegare il cavo elettrico alla pompa. Nel software di controllo della pompa, regolare la configurazione dell'unità fluidica selezionando il tipo di slitta e impostando la viscosità del fluido.
Nei parametri di flusso, immettere il valore della sollecitazione di taglio e impostare la durata del ciclo e il tipo di flusso. Quindi fai clic sul pulsante di riproduzione per avviare l'esperimento. Ricordarsi di mantenere il vetrino con celle trattate con gli stessi supporti senza esposizione al flusso come controlli statici.
Applicare lubrificante a base di silicone sulle parti superiori e laterali della stazione di carico equibiassiale a 6 pozzetti da 25 millimetri. Seme 400.000 cellule sospese in tre millilitri a ciascun pozzetto delle piastre di coltura a fondo flessibile a 6 pozzetti rivestite con collagene. Incubare le celle in aria umidificata fino a raggiungere il 100% di confluenza.
Prima di iniziare il protocollo di allungamento, lavare le cellule una volta con PBS preriscaldato e aggiungere tre millilitri di terreno di coltura fresco per pozzetto. Inserire la piastra di base con tutte le stazioni di carico lubrificate nell'incubatore e collegare opportunamente il tubo con l'apparecchiatura di controllo del sistema di allungamento del bioreattore della cella di tensione. Attaccare ogni piastra di coltura a una guarnizione rossa fornita dal sistema del bioreattore.
Quindi inserirli nella piastra di base nell'incubatore. Posizionare tutte e quattro le piastre di coltura nella piastra di base per ottenere il vuoto e il carico di allungamento adeguati. Accendere l'apparecchiatura del controller e il sistema informatico.
Aprire il software di controllo FlexCell e configurare il regime desiderato includendo la percentuale di allungamento, la forma d'onda, la frequenza e il tempo. Salva il regime. Accendere il sistema di aspirazione, quindi selezionare il regime e fare clic su Start sullo schermo del computer per eseguire lo stretching.
Controllare che la membrana di silicone si muova e allunghi le cellule. Le cellule endoteliali aderenti potrebbero essere osservate da 4 a 10 giorni dopo l'estrazione. Inizialmente formano gruppi di cellule che mostrano una tipica morfologia di ciottoli.
Hanno espresso i marcatori EC CD31 e VE-caderina. Le hSVEC quando coltivate sotto sforzo di taglio si allineano nella direzione del flusso. Lo sforzo di taglio di 20 dynes per centimetro quadrato per 72 ore induce l'espressione di geni meccanosensibili tipici, KLF2, KLF4 e NOS3, indicando l'efficacia dello stimolo di taglio.
Il risultato dell'allungamento ciclico dipendeva dall'intensità applicata alle SVEC umane. Le cellule a basso allungamento hanno mostrato un pattern corticale F-actina simile alle cellule statiche. Senza cambiamenti nel rilascio di ossido nitrico fino a 72 ore, i nostri livelli arteriosi di allungamento hanno rimodellato il citoscheletro di actina dopo 24 ore e diminuito il rilascio di NO dopo 72 ore.
Oltre agli studi sullo stress meccanico, i ricercatori possono utilizzare le cellule isolate per eseguire vari metodi per espandere la conoscenza della funzione e della disfunzione delle cellule endoteliali. Seguendo il protocollo dimostrato, è possibile studiare qualsiasi altro tipo di cellule endoteliali sotto stress di taglio e stiramento.
