Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della borsa di studio concessa dal Consiglio Nazionale della Scienza e della Tecnologia (CONACYT) (702361). Gli autori riconoscono il programma di dottorato di ricerca in Scienze Chimiche Biologiche della Scuola Nazionale di Scienze Biologiche del National Polytechnic Institute.

Lo studio è stato condotto in conformità con lo standard ufficiale messicano NOM-062-ZOO-1999 e la guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. L'approvazione per lo studio è stata ottenuta dai Comitati di Ricerca, Etica e Biosicurezza dell'Ospedale Pediatrico del Messico (HIM/2023/006) e dal Comitato di Ricerca e Bioetica dell'Ospedale Generale del Messico Eduardo Liceaga (DI/21/501/04/62). Tre topi C57BL/6 di età compresa tra 6 e 8 settimane sono stati ottenuti dall'Ospedale Pediatrico del Messico, dove sono stati allevati in condizioni isolate in rack ventilati, in conformità con le linee guida istituzionali per la cura e l'uso degli animali.
1. Preparazione dei materiali e dei reagenti
<ol><li>Preriscaldare il PBS privo di Ca 2+ e Mg2+ e la soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) a 37 °C.</li>
	<li>Integrare la soluzione di HBSS con 100 μg/mL di Liberase e 4 μg/mL di DNasi (HBSS-LD). Assicurarsi che la soluzione mantenga un pH fisiologico di 7,4. NOTA: Sarà necessario 1 mL di soluzione di lavoro per midollo spinale.</li>
	<li>Preparare una soluzione isotonica al 90% per la centrifugazione in gradiente di densità (disponibile in commercio, vedere la tabella dei materiali) e preriscaldarla a 37 °C.</li>
	<li>Preparare il tampone colorante combinando il siero fetale bovino inattivato al 5% (FBS) con PBS e conservare la miscela su ghiaccio.</li>
	<li>Preriscaldare Dulbecco's Modified Eagle's Glucosio medio-alto (1 g/L) (DMEM) a 37 °C.</li>
	<li>Integrare il terreno DMEM con il 10% di FBS, 2 mM di L-glutammina, 200 U/mL di penicillina, 200 μg/mL di streptomicina e 500 pg/mL di amfotericina B (vedere la tabella dei materiali) per preparare DMEM-S.</li>
</ol>2. Dissezione e preparazione del midollo spinale
<ol><li>Sopprimere il topo con un sovradosaggio intraperitoneale di pentobarbital alla dose di 150 mg/kg. Sterilizza il torace e la schiena del topo usando etanolo al 70%. NOTA: Verificare che l'eutanasia sia andata a buon fine prima di procedere con la dissezione del topo.</li>
	<li>Radere la regione toracolombare e fissare le estremità alla tavola di dissezione con nastro adesivo.</li>
	<li>Usando un bisturi, praticare un'incisione accurata lungo la linea mediana dorsale dalla regione occipitale a quella sacrale (Figura 2).</li>
	<li>Con l'ausilio di un microscopio operatorio stereoscopico, sezionare a strati fino a raggiungere la colonna lombare e identificare l'ultima arcata costale. NOTA: Le 13 arcate costali sono articolate nelle vertebre toraciche; una volta sezionati, diventano visibili superiormente alla vertebraL1 2.</li>
	<li>Determinare l'ultima vertebra cervicale e l'osso sacro, quindi praticare un taglio per separare la colonna vertebrale (Figura 2).</li>
	<li>Utilizzando una pinza da dissezione, eseguire una laminectomia dorsale delle vertebre per estrarre il midollo spinale (Figura 3A-D). NOTA: Ad eccezione delle prime due vertebre cervicali (atlante e asse), tutte le vertebre mobili condividono un disegno morfologico comune in varie regioni (cervicale, toracica o lombare). Ogni tipica vertebra mobile presenta un corpo vertebrale cilindrico alla sua estremità anteriore. Attaccato alla parte posteriore del corpo c'è un arco osseo noto come arco vertebrale (arco neurale), costituito da lamine e processi spinosi. Tra queste strutture si trova il forame vertebrale15.</li>
	<li>Rimuovere i nervi che emergono attraverso i forami (radici dorsali e ventrali) che costituiscono il sistema nervoso periferico e possono contenere macrofagi infiltrati (Figura 3D). NOTA: Non è necessario rimuovere la pia madre o le meningi poiché il mezzo a gradiente di densità elimina efficacemente gli astrociti contaminanti. Inoltre, il mantenimento delle meningi riduce il tempo di purificazione e migliora la vitalità.</li>
</ol>3. Digestione tissutale e isolamento della microglia
<ol><li>Posizionare il midollo spinale sulla tavola da dissezione e, usando le forbici Vannas, tagliare il midollo spinale in pezzi di 2 mm, ottenendo una media di 10 pezzi.</li>
	<li>Trasferire le sezioni del midollo spinale in una microprovetta a fondo piatto da 2 mL (Figura 3E,F).</li>
	<li>Aggiungere 1 mL della soluzione di lavoro HBSS-LD (passaggio 1.2). Incubare a 37 °C per 25 min, vostrando energicamente ogni 5 min.</li>
	<li>Passare il contenuto di ogni digestione attraverso un colino da 40 μm, quindi aggiungere 7 mL di HBSS con FBS al 2% per neutralizzare la digestione.</li>
	<li>Frantumare il tessuto rimanente utilizzando uno stantuffo per siringa da 1 ml. Centrifugare la sospensione in una provetta conica da 50 mL per 5 minuti a 220 x g, 4 °C.</li>
	<li>Scartare il surnatante utilizzando una micropipetta da 1 mL e risospendere il pellet in 2 mL di HBSS con FBS al 2% in una provetta conica da 15 mL. Combinare con 2 mL di terreno a gradiente di densità isotonica al 90%. Centrifugare per 25 minuti a 160 x g, 18 °C. NOTA: Utilizzare un'accelerazione lenta ed evitare di utilizzare il freno.</li>
	<li>Utilizzare una pipetta di trasferimento per recuperare l'interfaccia e trasferirla in una provetta conica da 15 mL. Lavare le cellule con 10 mL di PBS e centrifugare per 5 minuti a 220 x g, 4 °C.</li>
	<li>Risospendere le cellule in DMEM-S (passaggio 1.6) e conservarle sul ghiaccio.</li>
</ol>4. Determinazione della purezza/vitalità
<ol><li>Per quantificare le cellule vitali utilizzando una camera emocitometrica, utilizzare un colorante blu di tripano allo 0,4% (vedi Tabella dei materiali). NOTA: In media, un singolo topo fornisce 4-6 milioni di cellule.</li>
	<li>Per quantificare le cellule vitali tramite un citometro a flusso, utilizzare la colorazione fluorescente reattiva alle ammine disponibile in commercio (vedere la tabella dei materiali).<ol><li>Trasferire 1 milione di cellule in una provetta a fondo tondo in polistirene da 5 mL (FACS). Diluire il colorante fluorescente con PBS in un rapporto di 1:1000 (creando la soluzione di lavoro di vitalità).</li>
		<li>Incubare i campioni con la soluzione vitale al buio a 4 °C per 30 minuti. Lavare le celle con PBS ghiacciato due volte. Risospendere le cellule in 400 μL di tampone colorante (passaggio 1.4).</li>
		<li>Bloccare le cellule con 2.4G2 anti-FcRIII/I (vedere la tabella dei materiali) nel tampone di colorazione ghiacciato per 15 minuti a 4 °C.</li>
		<li>Formulare il cocktail di colorazione degli anticorpi aggiungendo gli anticorpi monoclonali marcati con fluorescenza CD45-PerCP e CD11b-eFluor 450 al tampone colorante (a una diluizione di 1:300) (vedere Tabella dei materiali). NOTA: Sebbene siano disponibili entrambe le tecniche, scegliere quella che meglio si allinea con il protocollo successivo.</li>
		<li>Incubare i campioni con il cocktail colorante anticorpale al buio a 4 °C per 30 minuti. Lavare due volte le cellule con tampone colorante ghiacciato. Risospendere le cellule in 400 μL di tampone colorante.</li>
		<li>Acquisire 250.000 eventi su un citometro a flusso, come descritto dalla strategia di gating nel passaggio 6 (Figura 4).</li>
	</ol></li>
</ol>5. Colorazione immunofluorescente
<ol><li>Posizionare un vetrino coprioggetto pretrattato in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. NOTA: Per trattare i vetrini coprioggetti, metterli in una capsula di Petri con 500 μL di soluzione di L-polilisina (0,01 mg/mL, vedere la tabella dei materiali) e incubare per 1 ora. Successivamente, lavali tre volte con acqua distillata e lasciali asciugare.</li>
	<li>Seminare 200.000 cellule sul vetrino coprioggetto trattato utilizzando 500 μL di soluzione DMEM-S. Incubare per 24 ore.</li>
	<li>Rimuovere i vetrini coprioggetti e fissare le celle con paraformaldeide (PFA) al 3,7% per 20 minuti a temperatura ambiente. Lavare i vetrini coprioggetti tre volte con PBS ghiacciato.</li>
	<li>Permeabilizzare le cellule con Triton X-100 allo 0,2% in PBS per 15 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, lavare i vetrini coprioggetti tre volte con PBS freddo. Bloccare le celle con BSA allo 0,2% in PBS per 1 ora a temperatura ambiente.</li>
	<li>Diluire gli anticorpi monoclonali marcati con fluorescenza (a una diluizione di 1:300, vedere la tabella dei materiali) nella soluzione bloccante e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare i vetrini coprioggetti tre volte con PBS ghiacciato.</li>
	<li>Applicare il mezzo di montaggio contenente DAPI sul vetrino, quindi sigillarlo con un vetrino coprioggetti. NOTA: I vetrini possono essere immediatamente analizzati utilizzando un microscopio a fluorescenza o confocale, oppure possono essere conservati per un massimo di 3 mesi a -20°C.</li>
</ol>6. Strategia di gating per la microglia del midollo spinale
<ol><li>Generare un dot plot e stabilire un gate per isolare le cellule vitali in base alla colorazione di vitalità e a un canale fluorescente vuoto16. Escludi le cellule non vitali.</li>
	<li>Produrre un altro grafico utilizzando i parametri di dispersione in avanti e laterale per eliminare i detriti16.</li>
	<li>Sviluppare un ulteriore dot plot e analizzare l'espressione di CD11b e CD45 per differenziare la microglia.</li>
</ol>

Estrazione e purificazione enzimatica della microglia dal midollo spinale del topo

<ol>
	<li>Schr&#246;der, H., Schr&#246;der, , Moser, , Huggenberger, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neuroanatomy of the Mouse. , 59-78 (2020).</li><li>Sengul, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoarchitecture+of+the+spinal+cord+of+the+postnatal+(P4)+mouse.">Cytoarchitecture of the spinal cord of the postnatal (P4) mouse.</a> Anat Rec. 295, 837-845 (2012).</li><li>Bab, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microtomographic atlas of the mouse skeleton. VIII, 205 (2007).</li><li>Nayak, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+development+and+function.">Microglia development and function.</a> Annu Rev Immunol. 32, 367-402 (2014).</li><li>Martinez, F. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+and+polarization.">Macrophage activation and polarization.</a> Front Biosci. 13, 453-461 (2008).</li><li>Masuda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+heterogeneity+in+the+single-cell+era.">Microglia heterogeneity in the single-cell era.</a> Cell Rep. 30 (5), 1271-1281 (2020).</li><li>Prinz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+biology:+one+century+of+evolving+concepts.">Microglia biology: one century of evolving concepts.</a> Cell. 179 (2), 292-311 (2019).</li><li>de Haas, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Region-specific+expression+of+immunoregulatory+proteins+on+microglia+in+the+healthy+CNS.">Region-specific expression of immunoregulatory proteins on microglia in the healthy CNS.</a> Glia. 56 (8), 888-894 (2008).</li><li>Xuan, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+of+microglia+in+the+brain+and+the+spinal+cord.">Differences of microglia in the brain and the spinal cord.</a> Front Cell Neurosci. 13, 504 (2019).</li><li>Paolicelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+states+and+nomenclature:+A+field+at+its+crossroads.">Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads.</a> Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+IL-36&#947;/IL-36R+participates+in+the+maintenance+of+chronic+inflammatory+pain+through+astroglial+JNK+pathway.">Spinal IL-36&#947;/IL-36R participates in the maintenance of chronic inflammatory pain through astroglial JNK pathway.</a> Glia. 67 (3), 438-451 (2019).</li><li>Prinz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+central+nervous+system-associated+macrophages-from+origin+to+disease+modulation.">Microglia and central nervous system-associated macrophages-from origin to disease modulation.</a> Annu Rev Immunol. 39, 251-277 (2021).</li><li>Yip, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+and+culture+of+primary+microglia+from+adult+mouse+spinal+cord.">Rapid isolation and culture of primary microglia from adult mouse spinal cord.</a> J Neurosci Methods. 183 (2), 223-237 (2009).</li><li>Akhmetzyanova, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severity-+and+time-dependent+activation+of+microglia+in+spinal+cord+injury.">Severity- and time-dependent activation of microglia in spinal cord injury.</a> Int J Mo. Sci. 24 (9), 1-16 (2023).</li><li>Mahadevan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+vertebral+column.">Anatomy of the vertebral column.</a> Surgery. 36 (7), 327-332 (2018).</li><li>Krukowski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporary+microglia-depletion+after+cosmic+radiation+modifies+phagocytic+activity+and+prevents+cognitive+deficits.">Temporary microglia-depletion after cosmic radiation modifies phagocytic activity and prevents cognitive deficits.</a> Sci Rep. 8 (1), 1-13 (2018).</li><li>Cardona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+murine+microglial+cells+for+RNA+analysis+or+flow+cytometry.">Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry.</a> Nat Protoc. 1, 1947-1951 (2006).</li><li>Schmidt, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+enzymatic+efficiency+of+Liberase+TM+and+tumor+dissociation+enzyme:+effect+on+the+viability+of+cells+digested+from+fresh+and+cryopreserved+human+ovarian+cortex.">Comparison of the enzymatic efficiency of Liberase TM and tumor dissociation enzyme: effect on the viability of cells digested from fresh and cryopreserved human ovarian cortex.</a> Reprod Biol Endocrinol. 16 (57), 1-14 (2018).</li><li>Kusminski, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MitoNEET-parkin+effects+in+pancreatic+&#945;-+and+&#946;-cells,+cellular+survival,+and+intrainsular+cross+talk.">MitoNEET-parkin effects in pancreatic &#945;- and &#946;-cells, cellular survival, and intrainsular cross talk.</a> Diabetes. 65 (6), 1534-1555 (2016).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Numerosi protocolli sono stati sviluppati per lo studio della microglia a causa della loro importanza nell'omeostasi cerebrale. In questi metodi, le microglia provengono tipicamente dagli emisferi cerebrali di ratti e topi embrionali o neonatali17. Un numero limitato di studi ha affrontato la purificazione della microglia dal midollo spinale di topi adulti13,14. Queste tecniche prevedono la digestione enzimatica utilizzando collagenasi e/o...

La caratteristica distintiva dei vertebrati è la colonna vertebrale o colonna vertebrale, in cui la notocorda è stata sostituita da una sequenza di ossa segmentate chiamate vertebre, divise da dischi intervertebrali. Questa successione di materiale osseo modella il canale spinale, una cavità che racchiude e protegge il midollo spinale1. Nel genere Rodentia, la colonna vertebrale è solitamente formata da sette vertebre cervicali, tredici vertebre toraciche, sei vertebre lombari e un numero variabile di vertebre caudali 2,3. La lunghezza del midollo spinale è simile a quella della colonna vertebrale e il filum terminale è una struttura non nervosa che ancora il midollo spinale all'osso sacro. Inoltre, le fibre nervose escono attraverso il forame intervertebrale1.
Lo sviluppo e il corretto funzionamento del sistema nervoso centrale nei mammiferi dipendono in modo critico dall'attività dei macrofagi residenti nel sistema nervoso, chiamati microglia4. Sebbene le microglia siano state inizialmente descritte come fagociti residenti nel cervello, recenti ricerche hanno attribuito molte funzioni dinamiche a queste cellule 5,6. La dimensione della microglia varia da 7 a 10 μm in omeostasi; Sono considerate tra le cellule più versatili dell'organismo e possono adattarsi morfologicamente e funzionalmente al loro ambiente in continua evoluzione7. Queste cellule mostrano un'elevata eterogeneità sia durante la fase embrionale che adulta8,9, mentre nella fase adulta mostrano anche una complessa eterogeneità funzionale in base al loro contesto spazio-temporale10. L'eterogeneità e le molteplici funzioni della microglia consentono l'espressione genica differenziale e il comportamento nel midollo spinale e nel cervello. È stato dimostrato che l'espressione di CD11b, CD45, CD86 e CCR9 è maggiore nel midollo spinale rispetto al cervello 8,9.
Esistono diversi protocolli per l'isolamento della microglia cerebrale11,12; tuttavia, ne esistono solo pochi per la microglia del midollo spinale13,14. L'ottimizzazione di un metodo per la purificazione della microglia dal midollo spinale facilita lo sviluppo di molteplici studi incentrati sulla scoperta della fisiologia della microglia. Questo protocollo ha lo scopo di descrivere un'estrazione semplice e altamente riproducibile del midollo spinale di topo e la purificazione della microglia (Figura 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL collection tubes</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL microtubes</td>
			<td>Axygen, USA</td>
			<td>MCT-200-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.4G2 anti-FcR</td>
			<td>BioLegend, USA</td>
			<td>101302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL collection tubes</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (penicillin, streptomycin, amphotericin b)</td>
			<td>Gibco, USA</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD11b eFluor 450 anti-mouse</td>
			<td>eBioscience, USA</td>
			<td>48-0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD45 PerCP anti-mouse&#160;&#160;</td>
			<td>BioLegend, USA</td>
			<td>103130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balanced salt solution (PBS) calcium- magnesium-free</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue Cell Strainer 40 &#956;m</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 6-well Clear Not Treated&#160;</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>CLS3736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Heating Shaking Drybath&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific Digital HS Drybath, USA</td>
			<td>88870001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting forceps for microsurgery</td>
			<td>FT by DUMONT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Roche, USA</td>
			<td>4536282001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s Modified Eagle&#180;s Medium-high glucose (DMEM)&#160;</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td>D6429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric shaver</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tube</td>
			<td>Thermo, USA</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>PAN Biotech, Alemania</td>
			<td>P30-3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer Cytoflex&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s balanced salt solution&#160;</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td>H2387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Corning, USA&#160;</td>
			<td>15393631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase TM&#160;</td>
			<td>Roche, USA</td>
			<td>5401119001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber Counting Chambers</td>
			<td>China</td>
			<td>1103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll&#160;</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td>17089101</td>
			<td>density gradient centrifugation&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution&#160;</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel No. 25&#160;</td>
			<td>HERGOM, Mexico</td>
			<td>H23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snaplock Microcentrifuge Tubes 2 mL</td>
			<td>Axygen, USA</td>
			<td>10011-680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscopic microscope</td>
			<td>Velab, Mexico</td>
			<td>HG927831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight surgical scissors (10 cm)</td>
			<td>HERGOM, Mexico</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Vannas scissors</td>
			<td>HERGOM, Mexico</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue Stain 0.4%&#160;</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>DLAB, China</td>
			<td>8031102000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Aqua Fixable Viability Kit</td>
			<td>BioLegend, USA</td>
			<td>423102</td>
			<td>amine-reactive fluorescent dye staining&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid and efficient enrichment of mouse spinal cord microglia

La colonna vertebrale definisce un vertebrato e modella il canale spinale, una cavità che racchiude e protegge il midollo spinale. Il corretto sviluppo e la funzione del sistema nervoso centrale dei mammiferi dipendono in modo significativo dall'attività dei macrofagi residenti noti come microglia. Le microglia mostrano eterogeneità e multifunzionalità, consentendo un'espressione genica e un comportamento distinti all'interno del midollo spinale e del cervello. Numerosi studi hanno esplorato la funzione della microglia cerebrale, descrivendo in dettaglio i metodi di purificazione. Tuttavia, la purificazione della microglia dal midollo spinale nei topi manca di una descrizione completa. Al contrario, l'utilizzo di una collagenasi altamente purificata, al contrario di un estratto non raffinato, manca di segnalazione all'interno dei tessuti del sistema nervoso centrale. In questo studio, la colonna vertebrale e il midollo spinale sono stati asportati da topi C57BL/6 di 8-10 settimane. La successiva digestione ha impiegato una collagenasi altamente purificata e la purificazione della microglia ha utilizzato un gradiente di densità. Le cellule sono state sottoposte a colorazione per citometria a flusso, valutando la vitalità e la purezza attraverso la colorazione CD11b e CD45. I risultati hanno prodotto una vitalità media dell'80% e una purezza media del 95%. In conclusione, la manipolazione della microglia di topo ha comportato la digestione con una collagenasi altamente purificata, seguita da un gradiente di densità. Questo approccio ha effettivamente prodotto consistenti popolazioni di microglia del midollo spinale.

The defining characteristic of vertebrates is the vertebral column or spine, in which the notochord has been replaced by a sequence of segmented bones called vertebrae, divided by intervertebral discs. This succession of osseous material shapes the spinal canal, a cavity that encloses and protects the spinal cord1. In the genus Rodentia, the spine is usually formed by seven cervical vertebrae, thirteen thoracic vertebrae, six lumbar vertebrae, and a variable number of caudal vertebrae2,3. The length of the spinal cord is similar to that of the spine, and the terminal filum is a non-nervous structure that anchors the spinal cord to the sacrum. Additionally, nerve fibers exit through the intervertebral foramen1.
The development and proper function of the central nervous system in mammals critically depend on the activity of the nervous system&#39;s resident macrophages, called microglia4. Although microglia were initially described as brain resident phagocytes, recent research has attributed many dynamic functions to these cells5,6. Microglia&#39;s size ranges from 7 to 10 &#181;m in homeostasis; they are considered among the most versatile cells in the body and can adapt morphologically and functionally to their constantly changing environment7. These cells exhibit high heterogeneity during both the embryonic and adult stages8,9, while in the adult stage, they also display complex functional heterogeneity based on their spatiotemporal context10. The heterogeneity and multiple functions of microglia allow for differential gene expression and behavior in the spinal cord and brain. It has been shown that CD11b, CD45, CD86, and CCR9 expression is higher in the spinal cord compared to the brain8,9.
Multiple protocols exist for cerebral microglia isolation11,12; however, only a few exist for spinal cord microglia13,14. Optimizing a method for purifying microglia from the spinal cord facilitates the development of multiple studies focused on discovering microglia physiology. This protocol aims to describe a simple and highly reproducible extraction of the mouse spinal cord and the purification of microglia (Figure 1).

Autore in primo piano: Ricerca sulla microglia sull'eterogeneità e la purificazione del midollo spinale 

Arricchimento rapido ed efficiente della microglia del midollo spinale del topo

Our research focuses on the heterogeneity of microglia, which can exhibit both pro and anti-inflammatory behaviors across different pathologies and regions like the brain and spinal cord. We aim to enable a deeper understanding of spinal cord microglia behavior in diverse scenarios. The heterogeneity of microglia has made it difficult to classify them.This year, a new and broad classification has been proposed that goes beyond just a pro or anti-inflammatory status. Currently, achieving high purity and gel in isolating spinal cord microglia from animal models of neurological pathologies is a significant experiment and challenge. We identified a novel cytokine signaling pathway in the spinal cord microglia during chronic pain.Our protocol allows for a more controlled and somatic digestion, followed by a density gradient. Both result in less contamination by astrocytes compared to currently employed techniques for the purification of microglia from the spinal cord, brain, or embryos.

Utilizzando il tessuto del midollo spinale di topo, la digestione enzimatica è stata eseguita utilizzando una miscela altamente arricchita con collagenasi e termolisina. Il tessuto digerito risultante è stato sottoposto a passaggio attraverso un filtro da 40 μm per eliminare il materiale non digerito. Le cellule raccolte sono state arricchite attraverso un gradiente di densità Percoll, con il 90% nella porzione inferiore e il 45% nella porzione superiore. Le cellule arricchite di microglia all'interno dell'interfacci...

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Le microglia sono considerate alcune delle cellule più versatili del corpo, capaci di adattamento morfologico e funzionale. La loro eterogeneità e multifunzionalità consente il mantenimento dell'omeostasi cerebrale, pur essendo legata a diverse patologie neurologiche. Qui viene descritta una tecnica per purificare la microglia del midollo spinale.

The vertebral column defines a vertebrate and shapes the spinal canal, a cavity that encloses and safeguards the spinal cord. Proper development and ...

La nostra ricerca si concentra sull'eterogeneità della microglia, che può mostrare comportamenti sia pro che antinfiammatori in diverse patologie e regioni come il cervello e il midollo spinale. Il nostro obiettivo è quello di consentire una comprensione più profonda del comportamento della microglia del midollo spinale in diversi scenari. L'eterogeneità delle microglia ha reso difficile la loro classificazione.Quest'anno è stata proposta una nuova e ampia classificazione che va oltre il semplice status pro o antinfiammatorio. Attualmente, ottenere un'elevata purezza e gel nell'isolare la microglia del midollo spinale da modelli animali di patologie neurologiche è un esperimento e una sfida significativi. Abbiamo identificato una nuova via di segnalazione delle citochine nella microglia del midollo spinale durante il dolore cronico.Il nostro protocollo permette una digestione più controllata e somatica, seguita da un gradiente di densità. Entrambi si traducono in una minore contaminazione da parte degli astrociti rispetto alle tecniche attualmente impiegate per la purificazione della microglia dal midollo spinale, dal cervello o dagli embrioni.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Rapid and Efficient Enrichment of Mouse Spinal Cord Microglia

1.2K Views.  Mexico Children's Hospital. La nostra ricerca si concentra sull'eterogeneità della microglia, che può mostrare comportamenti sia pro che antinfiammatori in diverse patologie e regioni come il cervello e il midollo spinale. Il nostro obiettivo è quello di consentire una comprensione più profonda del comportamento della microglia del midollo spinale in diversi scenari. L'eterogeneità delle microglia ha reso difficile la loro classificazione.Quest'anno è stata proposta una nuova e ampia classificazione che va ...

Video: Autore in primo piano: Ricerca sulla microglia sull'eterogeneità e la purificazione del midollo spinale 

The vertebral column defines a vertebrate and shapes the spinal canal, a cavity that encloses and safeguards the spinal cord. Proper development and function of the mammalian central nervous system rely significantly on the activity of resident macrophages known as microglia. Microglia display heterogeneity and multifunctionality, enabling distinct gene expression and behavior within the spinal cord and brain. Numerous studies have explored cerebral microglia function, detailing purification methods extensively. However, the purification of microglia from the spinal cord in mice lacks a comprehensive description. In contrast, the utilization of a highly purified collagenase, as opposed to an unrefined extract, lacks reporting within central nervous system tissues. In this study, the vertebral column and spinal cord were excised from 8-10 week-old C57BL/6 mice. Subsequent digestion employed a highly purified collagenase, and microglia purification utilized a density gradient. Cells underwent staining for flow cytometry, assessing viability and purity through CD11b and CD45 staining. Results yielded an average viability of 80% and a mean purity of 95%. In conclusion, manipulation of mouse microglia involved digestion with a highly purified collagenase, followed by a density gradient. This approach effectively produced substantial spinal cord microglia populations.

Microglia are regarded as some of the most versatile cells in the body, capable of morphological and functional adaptation. Their heterogeneity and multifunctionality enable the maintenance of brain homeostasis, while also being linked to various neurological pathologies. Here, a technique for purifying spinal cord microglia is described.

Ricerca

Neuroscienze

Liberase-Based Enzymatic Purification of Microglial Cells Isolated from a Mouse Spinal Cord

To begin, with a scalpel, make an incision along the dorsal midline of a euthanized mouse from the occipital to the sacral region. Using a stereoscopic surgical microscope, carefully dissect through layers until the lumbar spine. Identify the last costal arch.Identify the last cervical vertebra and the sacrum. Then make a cut to separate the spine. With a pair of dissecting forceps, perform a dorsal laminectomy of the vertebra to extract the spinal cord.Remove the nerves emerging through the foramina which constitute the peripheral nervous system. Now, place the extracted spinal cord on a dissecting board. With a pair of vannas scissors, cut it into two-millimeter sized pieces.Then transfer the pieces to a two-milliliter flat-bottomed microtube. Add one milliliter of HBSS-LD working solution to the microtube. Incubate the mixture at 37 degrees Celsius for 25 minutes.Make sure to vigorously vortex the mixture every five minutes. Next, pass the contents of each digestion through a 40-micron-size strainer. Then add seven milliliters of HBSS with 2%FBS to neutralize the digestion and crush the remaining tissue.Transfer the suspension to a 50-milliliter conical tube before centrifuging it at 220 g for five minutes at four degrees Celsius. Now use a one-milliliter micropipette to discard the supernatant. Then resuspend the pellet in two milliliters of HBSS-FBS in a new 15-milliliter conical tube.Add two milliliters of 90%isotonic density gradient medium to the tube, and centrifuge the mixture at 160 g for 25 minutes at 18 degrees Celsius. Finally, with a transfer pipette, retrieve the interphase and transfer it to a 15-milliliter conical tube. Wash the cells with 10 milliliters of PBS, then centrifuge the cells at 220 g for five minutes at five degrees Celsius before further experimentation.The purification of the extracted microglial cells yielded up to 99%cell yield as confirmed by FACS staining. Double positive cells with an average size of 10 micrometers consistent with nonactivated microglia were observed.