La preparazione dei campioni criogenici deve affrontare sfide che possono limitarne l'efficacia, in particolare la distribuzione irregolare delle particelle. Questo problema spesso porta a una scarsa risoluzione e a una ridotta accuratezza nelle nuove strutture proteiche costruite. Vari approcci sperimentali vengono utilizzati per superare la distribuzione irregolare delle particelle, tra cui l'aggiunta di detergenti o imitatori della membrana al campione, la modifica del film di supporto della griglia e l'inclinazione di uno stadio specifico durante la raccolta dei dati.
Questo protocollo analizza un metodo pratico semplice per affrontare la distribuzione irregolare delle particelle attraverso l'ottimizzazione della preparazione dei campioni, fornendo il nostro riferimento ai ricercatori per illustrare in modo efficiente le strutture delle macromolecole utilizzando il criogeno. Per iniziare, raccogli le frazioni proteiche raggruppate contenenti la proteina MJ small heat shock 16.5. Utilizzare filtri centrifughi con un taglio del peso molecolare di 50 kilodalton per concentrare le frazioni a quattro gradi Celsius a circa 65 milligrammi.
Dopo la concentrazione, centrifugare il campione a 16.000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius per rimuovere gli aggregati. Aliquotare 50 microlitri di volumi di surnatante in provette per PCR a parete sottile da 0,2 millilitri. Per la microscopia elettronica a trasmissione, scongelare due provette proteiche congelate su ghiaccio.
Una volta scongelato, sbattere più volte il tubo per mescolare. Quindi centrifugare la soluzione proteica a 16.000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius per rimuovere gli aggregati. Successivamente, iniettare il surnatante su una colonna per cromatografia ad esclusione dimensionale e raccogliere frazioni di eluizione di 0,5 millilitri.
Raccogli le frazioni eluciane corrispondenti al picco, esibendo la più alta assorbanza ultravioletta a 280 nanometri. Per la sostituzione del tampone, con un paio di forbici, tagliare una membrana di dialisi in pezzi di 30 per 30 millimetri. Incubare i pezzi in acqua distillata o in soluzioni tampone per equilibrarli.
Quindi, aggiungere 55 microlitri di soluzione proteica in una camera con pulsanti di microdialisi da 50 microlitri. Tenere la membrana per dialisi in verticale con una pinza e toccare delicatamente un bordo della membrana contro la carta velina per drenare il liquido in eccesso. Coprire accuratamente il pulsante di microdialisi con la membrana.
Posizionare l'O-ring sopra la membrana per dialisi e arrotolarlo delicatamente nella scanalatura sul bordo del pulsante. Immergere ciascun pulsante di dialisi in un becher separato contenente il tampone di destinazione con il lato della membrana rivolto verso l'alto. Utilizzare una siringa con ago sottile per perforare con cura la membrana e recuperare la soluzione proteica dalla camera di microdialisi.
Caricare cinque microlitri di campione a una concentrazione compresa tra 20 e 120 nanogrammi per millilitro su una griglia di scarica a incandescenza. Preparare tre gocce d'acqua da 50 microlitri ciascuna su un foglio di pellicola di paraffina. Strofinare la superficie della griglia contro le gocce d'acqua per lavare il campione.
Ora carica cinque microlitri di soluzione filtrata di acetato di orinatoio all'1% sulla griglia e pipetta immediatamente la soluzione di acetato di orinatoio. Caricare altri cinque microlitri della soluzione di acetato per orinatoio sulla griglia. Toccare delicatamente il lato della pinzetta della griglia con carta da filtro per rimuovere la soluzione colorante in eccesso e lasciare asciugare la griglia.
Montare le pinzette e il gruppo della griglia di scarica a incandescenza sullo strumento. Quindi caricare quattro microlitri di campione sul lato in carbonio della griglia. Avviare il processo di congelamento a tuffo.
Per preparare le griglie da caricare sul microscopio elettronico a trasmissione, o TEM, posizionare prima una scatola a griglia contenente griglie vetrificate nella stazione di assemblaggio della griglia automatica e svitare il coperchio di una scatola a griglia contenente griglie vetrificate. Posizionare l'anello della griglia automatica nell'apposito spazio di apertura della stazione di assemblaggio. Spostare con cautela la griglia vetrificata dalla scatola della griglia e inserirla all'interno dell'anello della griglia automatica.
Ora allinea il disco per posizionare l'apertura circolare sopra l'anello della griglia automatica e il gruppo griglia. Per fissare la griglia nell'anello della griglia automatica, posizionare lo strumento di inserimento della clip a C sopra la griglia e premere delicatamente verso il basso per fissare la clip a C all'interno. Ruotare il disco all'indietro e spostare le griglie assemblate nella scatola di conservazione della griglia automatica.
Montare la stazione di caricamento della cassetta e raffreddarla con azoto liquido. Posizionare il contenitore a griglia automatica nella stazione di carico. Spostare il gruppo griglia dalla scatola di stoccaggio della griglia automatica alla cassetta.
Utilizzare la maniglia per posizionare la cassetta nella capsula del caricatore automatico. Controllare il perno nel caricatore automatico per confermare il suo libero movimento e assicurarsi che non sia congelato. L'accumulo di particelle negli array è stato osservato su tutte le griglie testate, indipendentemente dalle condizioni tampone o dalle modifiche della carica superficiale.
Una maggiore concentrazione proteica combinata con griglie caricate negativamente in nove millimolari di mobstress, 50 millimolari di cloruro di sodio e 0,1 millimolari di tampone EDTA hanno portato alla distribuzione desiderata di singole particelle all'interno dei fori della griglia, riducendo la formazione di array proteici. Questa condizione ottimizzata ha portato a un elevato valore del rapporto di area FSC conico di 0,80 e a un valore SCF di 0,859, confermando una distribuzione uniforme delle particelle.
