Durante l'ultimo decennio, sono stati sviluppati modelli di lesione cerebrale traumatica lieve in roditori con trauma cranico chiuso. Tuttavia, l'implementazione di questi modelli nello sviluppo di roditori è scarsa rispetto alla letteratura sul trauma cranico adulto. Per affrontare la questione con rilevanza clinica, questo studio ha sviluppato un trauma cranico chiuso con disturbi a lungo termine, o modello CHILD TBI.
Per molto tempo, la lesione cerebrale traumatica si è concentrata sulle conseguenze di gravi lesioni cerebrali. Negli ultimi due decenni sono stati segnalati lievi effetti del trauma cranico, ma pochi studi hanno valutato le conseguenze a lungo termine. Con un nuovo sviluppo nel neuroimaging, c'è un crescente interesse per i risultati a lungo termine che mancavano per i modelli pediatrici.
CHILD è stato progettato per colmare questa lacuna. Utilizzando il modello CHILD, abbiamo caratterizzato cambiamenti progressivi e persistenti all'interno del cervello come morti neuronali, risonanza magnetica a diffusione alterata, attività e plasticità neuronale modificate, aumento della gliosi, perturbazioni comportamentali progressive e disfunzione cardiaca con l'età. Il nostro nuovo modello CHILD presenta il vantaggio di essere eseguito e riproducibile in diversi laboratori.
Con un'ampia adozione, potremmo aspettarci un'estensione delle conoscenze sulle conseguenze a lungo termine della commozione cerebrale pediatrica. Utilizzando il modello CHILD, stiamo continuando a studiare gli effetti e le conseguenze dello stress ripetitivo. Abbiamo già iniziato a studiare come gli effetti combinati dell'infezione precoce dopo la nascita e del bambino possano contribuire a risultati a lungo termine.
Inoltre, osserviamo la protezione del letto vascolare dopo stress ripetuti, suggerendo che potrebbe verificarsi un precondizionamento dopo un'infezione precoce, ma questo attende ulteriori indagini. Per iniziare, riscalda in anticipo la camera per l'induzione dell'anestesia e le gabbie di recupero utilizzando cuscinetti riscaldanti per prevenire l'ipotermia. Impostare l'apparato stereotassico con l'impattatore montato a un angolo di 90 gradi.
Verificare che tutte le parti dell'apparato stereotassico siano correttamente serrate e fissate. Verificare che il pistone sia saldamente avvitato nel dispositivo di simulazione. Quindi, taglia un foglio di alluminio e avvolgi il telaio stereotassico con un foglio per creare un cuscinetto su cui l'animale possa riposare.
Fissare la posizione e la tensione della pellicola utilizzando del nastro da laboratorio per sostenere il peso dell'animale. Successivamente, accendi il controller dell'impattatore e regola la velocità di impatto a due metri al secondo per il primo grado o a tre metri al secondo per il secondo grado, in base alla gravità della lesione. Quindi, pesare gli animali su una bilancia.
Dopo aver anestetizzato il mouse, posizionare la testa del mouse sotto l'impattatore. Assicurati che il cucciolo sia completamente disteso in lunghezza. Verificare che la punta dell'impattatore di tre millimetri di diametro sia ricoperta di gomma per ridurre al minimo il contatto del metallo con il cranio.
Ora, sposta la manopola sulla posizione Extend per abbassare l'impattatore. Abbassare grossolanamente l'impattatore, in modo che sia posizionato tra le orecchie del mouse. Quindi, fai scorrere il mouse in modo che la punta del pistone venga spostata in avanti dell'equivalente di una lunghezza della punta del pistone e di una lunghezza della punta a sinistra dell'animale.
Impostare il dispositivo di simulazione sulla posizione di ritrazione. Quindi, regolare la posizione del pistone per determinare la gravità della lesione. Imposta il tempo di permanenza su 0,1 secondi, indipendentemente dalla gravità della lesione.
Premere Impact sulla manopola destra per avviare l'impatto. Ruotare rapidamente la manopola sinistra in posizione Off per evitare il surriscaldamento del sistema. Quindi, posiziona il topo sul fianco destro in una gabbia di recupero.
Monitora e registra il tempo di scrittura quando il mouse si alza su tutte e quattro le gambe. Si noti il tempo in cui riprende il comportamento esplorativo. Una volta completamente recuperato, riporta il topo nella sua gabbia di casa.
Lavare le sezioni cerebrali quattro volte per 10 minuti ciascuna in PBS sotto agitazione. Trasferire le sezioni cerebrali nella soluzione bloccante e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Prendi gli anticorpi primari diluiti nella soluzione bloccante e aggiungi le sezioni cerebrali.
Incubare le sezioni per una notte a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione, lavare le sezioni quattro volte per 10 minuti ciascuna in PBS sotto agitazione. Trasferire le sezioni in una soluzione bloccante contenente anticorpi fluorescenti secondari diluiti da 1 a 1000 e incubare per un'ora a temperatura ambiente.
Dopo aver lavato le sezioni quattro volte in PBS, montarle sulle guide utilizzando un mezzo di montaggio. Aggiungere un vetrino coprioggetto a ciascuna diapositiva prima di conservarla a quattro gradi Celsius fino all'acquisizione dell'immagine. Acquisizione di immagini in immunofluorescenza utilizzando un microscopio a epifluorescenza e il software Micro-Manager.
Le femmine di topo nel gruppo G2 hanno mostrato un tempo significativamente più lungo per stare in piedi rispetto ai maschi all'interno dello stesso gruppo, ed entrambi i sessi hanno mostrato tempi prolungati rispetto ai controlli fittizi, con maggiori differenze tra i livelli di gravità G1 e G2. I topi femmina nel gruppo G2 hanno mostrato un tempo di esplorazione significativamente più lungo rispetto ai maschi ed entrambi i sessi hanno avuto tempi più elevati rispetto ai controlli fittizi, con aumenti significativi dipendenti dalla gravità tra G1 e G2. L'astrogliosi, evidenziata da un aumento della colorazione gliale delle proteine acide fibrillari, è stata osservata nella corteccia somatosensoriale omolaterale del gruppo G2 rispetto ai controlli fittizi a un giorno dopo l'infortunio. L'immunoistochimica NeuN non ha mostrato perdite neuronali significative un giorno dopo l'infortunio.
