トランスジェニックの生産アフリカツメガエル制限酵素を介した統合と核移植によって

要約

このビデオプロトコルは、トランスジェニックを生成する方法を示していますアフリカツメガエル未受精卵に核移植に続いて精子の核への導入遺伝子の導入による。

要約

アフリカツメガエルのゲノム中にクローニングされた遺伝子産物の安定的な統合は、胚発生の後期段階で遺伝子を発現すること、およびエンハンサーおよびプロモーターは、胚内で遺伝子発現を調節する方法を定義するために、式の時間と場所を制御する必要がある。ここに示したプロトコルを効率的にトランスジェニックアフリカツメガエルの胚を生産するために使用することができます。 1：このトランスジェネシスの手法は、三つの部分を含む。精子の核は、成人Xから分離されています精子形質膜をpermeabilizesリゾレシチンで処理してツメガエル精巣、。 2。卵抽出液を低速遠心分離、抽出物は細胞周期の間期へと進行させるためにカルシウムを加え、そして相間の細胞質を分離するため、高速遠心分離によって調製される。 3。核移植：核とエキスは、導入遺伝子及び制限酵素を少量として導入される直鎖状プラスミドDNAと結合されています。短い反応中に、卵抽出物は部分的に精子クロマチンをdecondensesと制限酵素は、ゲノムへの導入遺伝子の組換えを促進する染色体切断を生成します。処理された精子の核は、未受精卵に移植されています。導入遺伝子の統合は、通常、結果として得られる胚のキメラではないというような最初の胚の切断の前に発生します。これらの胚は、プロモーターと遺伝子機能の解析のためのトランスジェニック胚の効率的かつ迅速な世代を可能にする、次の世代に繁殖することを必要とせずに解析することができます。成人X.この手順に起因するツメガエルはまた生殖細胞を通じて導入遺伝子を伝播し、複数の目的のためのトランスジェニック動物の行を生成するために使用することができます。

プロトコル

このトランスジェネシスの手法の修正版は、当初¹および²に記載された。

A.精子核の準備

この核の調製法は、マレー³から適合されているが、それらは精子の核を移植した卵のその後の発展を妨げるとして、プロテアーゼ阻害剤が省略されている。アリコートを-80℃で凍結されており、約6ヶ月間の移植に使用することができます。

すべての溶液を調製し、事前の準備を始めるために氷の上に配置する必要があります。

1. 1月2日、成人男性のXを麻酔少なくとも20分間Tricaineの浸漬によるツメガエルは、ピッシングが続く、精巣を削除します。
2. 、血液、血管や脂肪体を除去1XMMRを含む60ミリメートルペトリ皿の中で簡単にそれらを洗浄し、脂肪体の任意の追加部分を削除するには、ペーパータオル上で睾丸を転がし。これは精子を解放するように、穿刺睾丸をしないように注意してください。
3. 目に見える塊がなくなるまで乾燥した60mmのペトリ皿やピンセットを用い、温浸法精巣に精巣を転送します。マセラシオンは、原子核の高収率を得ることなど、徹底的に可能な限り実行する必要があります。
4. 温浸法に優しく上下にピペッティングし、2mLs冷たい核準備のバッファを（1X株式からNPB）を追加します。
5. 約4を介して噴出柔らかくするには、15 mLの試験管（例えばファルコン2059年）に収集し、漏斗にチーズクロスの厚さは、NPBの8mLsで皿を洗い、これはチューブでそれを収集し、チーズクロスを介してリンス置く。手袋をはめた手でチューブに残った液を収集するために寒冷紗を絞る。
6. ペレットを10分間3000rpmで精子。 4℃で適当なチューブアダプター付きスイングバケットローター（ソーバルHB - 4ローターまたは同等の例：1480グラム）のC。上清をデカントし、このチューブのアドオン8mL NPBとペレットを再懸濁します〜10 mLのピペットでピペッティングし、上下、上記と上清をデカントとして再度スピンダウン。スピン中に室温にNPBの1mLの平衡化させます。
7. 1 mLのpipettemanヒントを使用して1mLの室温のNPBでペレットを再懸濁しますは、10mg/mLたてリゾレシチン50μlの追加、穏やかに混合し、5分間インキュベートする。室温で。
8. リゾレシチンの反応を停止させるチューブに10 mLの冷1XNPB +3％BSAを追加する、穏やかに混合し、スイングバケットローターで3000rpmで10分間スピンダウン。デカント上清。リゾレシチン処理されたペレットは、前のリゾレシチンの治療に比べ（以下不透明な白）やや透明になるはずです。
9. 5mLの冷NPB 0.3パーセントBSAの上清をデカントし、ペレットを再懸濁しますは、10 mLのピペットで静かに混和し、上記のように3000rpmの時に10分間スピンダウン。
10. 精子の保存バッファーおよび1.5 mlチューブへの転送の500μLの上清をデカントし、ペレットを再懸濁します。これはあなたの原子核の株式です。あなたが原子核の利回りをチェックしながら氷の上に保管してください。
11. 場所、精子の希釈バッファー（SDB）、核株式及び1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブにヘキスト社の株式の100倍希釈液1μlの1μlの98μlを核の収率を確認するには。わずか1μlを削除する前に、かみそり、クリップ（または大開口部）ピペットチップを使用して非常によく核株式を混ぜる。非常によく希釈SDB /ヘキスト/核を混合し、毛管現象によって改良されたノイの血球計算盤のチャンバー内に流入し、少量を許可する。化合物の顕微鏡下で血球計算盤の正方形の核を数える。ある男性から、1 - 2X10 ⁵細胞/μlの希釈していない株式の濃度の在庫のこの1:100希釈のために少なくとも100から200（X10 ⁴細胞/ ml）のカウントを取得する必要があります。あなたの在庫が少なく集中の場合、原子核は、数時間のために解決上清の一部を削除し、再集計ができます。 4で核を残す° Cグリセロールがより凍結保存のために浸透できるようにするために一晩、その後、大オリフィスピペットの先端でよく核株式をミックス20μlのアリコートを準備し、そして液体窒素で凍結。

高速抽出のB.の準備

このメソッドは、マレー³から適応され、追加された精子の核の膨潤および部分的なクロマチンの脱凝縮を促進する相間細胞質抽出液を生成される。抽出液は、-80℃で小分けで凍結し、使用前に解凍することができます。

1. HCG注射、素数8月12日大人の女性のXの前に3-5日背側リンパ嚢にPMSGの50 Uを注入することにより、 ツメガエル 。エキスの準備前の晩、2リットルの1XMMRに500台HCGと場所2カエル/コンテナで各カエルを注入する。卵を溶解または活性化するワンカエルのエキスの準備を危険にさらすことができるので、排卵のためにペアにカエルを分離することをお勧めします。
2. 翌朝、準備し、準備を開始する前にすべてのソリューションを冷やします。静かに、手動で大規模なbに各カエルの卵を排出する1X MMRを含むeakers。各コンテナから卵を選別し、手順から斑点、溶解またはアクティベーション（動物半球の色素沈着の収縮により可視化）の兆候と卵の任意のバッチを省略する。さらに色素沈着で切れ目のない卵を集める。良い卵は、カエルのバケットで1X MMRから収集することができます。卵の合計量は8-12人の女性から> 100mLのはずです。
3. 脱ゼリー卵。これを行うには、できるだけ多くのMMRを削除するシステイン溶液の少量を追加し、渦巻き卵を。新鮮なシステイン溶液で脱jellying中に数回交換してください。脱ゼリーを別々の卵の各バッチと破損や卵の活性化でバッチを捨てる。卵の残りの部分を組み合わせる。
4. プロテアーゼ阻害剤で卵の抽出バッファー（XB）の〜35 mLの4回、及びその後CSF - XBを25mLの2回洗浄する。
5. 卵をパックする：ベックマンultraclear管に卵を移す。卵が沈殿することができます。できるだけCSF - XB限りを削除します。 4℃〜60秒を1000rpm（150グラム）で、ベックマンSW 40 Tiローターを（または類似のローター）を使用して卵を遠心℃にパック卵の上から余分な溶液を除去。
6. 4℃で10分間10,000 rpmで（16,000 g）で卵を遠心℃に：卵をつぶすと、細胞質抽出物を生成するには脂質（上部）、細胞質（中央）、及び卵黄（底部）：卵は3つのレイヤーに分離する必要があります。細胞質層の基部にチューブを通して針を挿入することによって18ゲージ針で各試験管から細胞質層を収集する。氷の上に新鮮なultraclearベックマンチューブに細胞質を移す。
7. 1Xの最終濃度に分離された細胞質に、プロテアーゼ阻害剤を追加。 4℃で10分間16,000 gで細胞質をRecentrifuge℃に前述のように明確に細胞質を収集する。 0.75から1 mLの細胞質/カエルを得ることを期待。
8. サンプルへのエネルギーミックスの抽出量の1 / 20を追加。ベックマンTL - 100超遠心機用厚肉ポリカーボネートチューブに細胞質を移す。チューブは、3 mLのそれぞれについて保持と完全な少なくとも半分にする必要があります。
9. 0.4mMの最終濃度を各チューブに1 M CaCl _2を追加。室温で15分間チューブをインキュベートします。これにより、CSFを不活性化し、相間にエキスをプッシュします。
10. チューブのバランスをとり、4℃で1.5時間70,000 rpmで（200,000 g）でTLA - 100.3ローター℃を用いてベックマンTL - 100超遠心機でそれらを遠心細胞質は上から下へ、4つの層に分画するなります：脂質、細胞質、細胞膜/ミトコンドリア、及びグリコーゲン/リボソーム。
11. 脂質層を介してチューブの上部に注射器を挿入して、各チューブ（〜1 mLを2〜3 mLを試験管にロードされている場合）から細胞質層を削除します。新鮮なチューブに細胞質画分を移し、4℃で20分間70,000 rpmで（200,000 g）を℃でサンプルをrecentrifuge
12. 0.5 mLチューブに25μlを上清に分注し。使用するまで-80℃で液体窒素や店舗° Cのアリコートを急速凍結。エキスが有効であるかどうかを判断するには、精子核は抽出液中にインキュベートし、核が目に見えて、室温で加え、10分以内に（厚くし、長く）膨潤かどうかを判断するためにヘキストで染色することができます。

C.のトランスジェネシスの反応と核移植

重要：ソリューション、機器やカエルが反応を開始する前にすべての準備ができていることを確認してください。多くのコンポーネントが> 30分間安定した状態を維持しないので、いったん作業を開始するには、以下に説明するおおよその時刻表を使用して反応を進める必要があります。精子核の在庫は氷上で保持されていますが、形質転換反応（希釈と濃縮された両方）を室温で維持する必要があります。

1. 首相女性カエル。遺伝子導入前の夜、翌日から始まる新鮮な卵を得るために背側リンパ嚢におけるHCG 800台で、いくつかの（3-5）成人女性のカエルを注入する。
2. 形質転換の手順の一日、遺伝子導入に必要なソリューションを準備したり、温度にもたらす。
   1. 焼きたてのシステイン（1XMMR、pH8.0で2.5％）。あなたがその日に使用されるいくつかの百ミリリットルが必要になります。
   2. 移植の料理と胚を上げるためのトランスジェニック胚と0.2XMMR 100μg/ mLのゲンタマイシン（フィコールなし）の回復のための0.2XMMR +6％フィコール。ソリューションは、° C、高温以来悪影響を遺伝子導入し、胚発生の両方の周波数に影響を与える° Cとトランスジェニック胚を16と21との間の温度で早期に開裂によって発生させる必要がある18から21よりも暖かくてはいけません。
   3. 解凍し、その日の移植のためにSDBの室温冷凍アリコート（精子の希釈バッファー）に平衡化し、氷上での高速抽出と場所を解凍し、100mMのMgCl ₂溶液を準備する。
   4. 目を得る電子アガロースインジェクション料理とMMR /フィコール液で塗りつぶし、および設定し、流れを安定させるために輸液ポンプを事前に実行してください。
   5. 女性のカエルが産卵していると卵が高品質であることを確認してください。最適に、卵はしっかりと皮質を（デjellying後の形状を保持する）必要があります。
3. 遺伝子組み換えの反応を設定します。
   1. 非常に穏やかに（クリッピングピペットチップを使用して）核の株式を混在させると1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブに結合する：
      4μl原子核（〜4 - 8X10 ⁵核）
      2μlのは、直鎖化されたプラスミド（100ng/μl）
      室温で5分間インキュベートする。
   2. インキュベーションが進行している間に、4.5μlH ₂ Oで制限酵素の0.5μlを希釈し、SDBの18μl、MgCl ₂を2μlのと、高速抽出の2μlのために希釈した酵素1μlを加える。核-プラスミド反応するために、この混合物を追加。核の膨潤に10分以上インキュベートする。
   3. このインキュベーションの間に、システイン溶液で2-3カエルの卵と脱ゼリーを絞る。 1XMMRで（5倍）だけでなく、それらを洗浄し、0.2 × MMR +4％フィコールを含む各アガロースウェルディッシュに400から500 dejellied卵を転送するために広いボアピペットを使用してください。卵料理は、反応は通常希釈する準備ができて準備されればこれは通常ので、約10分かかります。
   4. 約15〜20分のステップを開始した後、静かに切り取られた先端との反応（核/抽出/ DNA）を混合し、室温で150〜5μlの約200μlSDBを追加。濃縮された混合物に残っているときに限り、移植の容量を保持していないのに対し、この希釈混合物中の核は、1時間程度。ために安定しています。
4. 針を読み込む：広いオリフィスのピペットチップを使用して非常に穏やかに上記で調製した希釈した反応を混ぜ合わせ、その後、核がチューブから急速に定着するので、速やかに針をロードする。荷物を積み込む針に、クリップされた200μlのピペットチップの先端に細かいタイゴンチューブを置きます。ピペットの先端にソリューションを引き、その後針にチューブを接続し、解決策が重力により針を入力またはピペットのプランジャーを押し下げることができます。
5. チューブをポンプし、核の移植を開始するために針を取り付けます。注射はダメージを与えることを避けるために、迅速な浅いとほぼ垂直に卵の細胞膜にしてください。フロー推奨さ（10nl/sec）の割合で、〜0.5秒のための卵に針を保つ。あなたは、20〜30分以内に移植の1〜2皿を完了する必要があります。

胚が4から8細胞期に達するまでの注射の後、16-20℃で料理を残す。 0.2XMMR +4％フィコールの新鮮な大きな皿に（先端のガラスパスツールピペットの卵とほぼ同じ直径）転送することにより、離れて自分の非切断隣人から切断胚を並べ替えます。少人数のグループ（/ウェル、6ウェルプレートの10〜15胚）と0.2XMMRの文化（無フィコール）初期の開発を通じて、100μg/ mlのゲンタマイシンに切断胚を分割します。どんな死に胚が速やかに除去し、メディアが必要に応じて変更して胚は原腸陥入時にチェックする必要があります。

トラブルシューティング：

1. 針がブロックされています：針からの溶液の流れは、移植時に明らかなはずである。針が目に見える粒子状物質によってブロックになった場合は、針を変更したり、鉗子で先端をクリッピングし、針を介して解決策を押すことにより破片を除去してみてください。
2. いいえ切断卵が得れていない：精子の核と注入量の希釈液が適切であることと、針が移植中にブロックされていないことを確認してください。注入量が多すぎると、卵はまた、代わりに切断するとは変色した色素沈着やダメージが表示されない場合があります。
3. 多くの胚は原腸形成中に死亡する。いくつかの要因は、胚の生存率を高めることができる。
   1. 準備中の原子核と酵素反応に注意してください。脱凝縮した核は壊れやすく、上記の時刻表を使用して移植する必要があります。氷の上に置かないでください。
   2. 酵素反応と核移植の間に精子の核によって支え染色体損傷は、形質転換の頻度と胚の正常な発展の両方に影響を与えます。核への染色体損傷は、形質転換の効率を高めるがマイナスの生存/正常な発達に影響を与えます。減少または酵素のインキュベーションの間に制限酵素を省略すると、通常の開発の速度を向上させることができますが、トランスジェネシスまたは胚のゲノムに導入したプラスミドコピー数の頻度を低下することがあります。
   3. 後期原腸胚を通じて胞胚は、変色や細胞死の兆候を示す場合には、移植に用いられる試薬は、卵に有毒であることも可能です。加えて、卵ならsが会社の皮質を持っていない、彼らはexogastrulationを受けると、通常のポスト原腸胚の生成に失敗することがあります。
4. 導入遺伝子を発現する胚の数は低いです。制限酵素の量を増やします。

代表的なトランスジェニック胚結果

興味のあるプロモーターからの発現が表示されるまで、核の移転から得られたトランスジェニック胚を送出しなければなりません。上記の図1では、筋アクチンプロモーターは、このトランスジェニックオタマジャクシの体節に緑色蛍光タンパク質の発現を駆動する。

ディスカッション

各トランスジェニックコンストラクトがテストするために、我々は一般的に500から1000の卵に細胞核を移植し、このスケールで、我々は、産卵のた​​めに誘導する方法多くの女性に応じて、一日あたり10種類の構成要素にまで発現するトランスジェニック胚を生成することができます。これらの移植のうち、卵を切断の約3分の1と、これらの切断胚の60〜80％は、通常、原腸形成を進めます。?...

資料