La production de transgéniques Xenopus laevis Intégration par médiation des enzymes de restriction et de la transplantation nucléaire

Résumé

Ce protocole vidéo montre une méthode pour générer des transgéniques Xenopus laevis Par l'introduction de transgènes dans les noyaux des spermatozoïdes suivie par transplantation nucléaire dans les œufs non fécondés.

Résumé

L'intégration stable de produits de gène cloné dans le génome de Xenopus est nécessaire de contrôler l'heure et le lieu d'expression, d'exprimer des gènes à des stades ultérieurs du développement embryonnaire, et de définir comment les amplificateurs et les promoteurs régulent l'expression génique au sein de l'embryon. Le protocole démontré ici peuvent être utilisés pour produire efficacement transgéniques Xenopus laevis embryons. Cette approche implique la transgénèse trois parties: 1. Noyaux spermatozoïdes sont isolés des adultes X. testicule laevis par traitement avec lysolécithine, qui perméabilise la membrane plasmique des spermatozoïdes. 2. Extraire des oeufs est préparé par centrifugation à faible vitesse, ajout de calcium pour provoquer l'extrait de progresser vers l'interphase du cycle cellulaire, et une centrifugation à haute vitesse pour isoler cytosol interphase. 3. Transplantation nucléaire: les noyaux et extraire sont combinés avec l'ADN plasmidique linéarisé d'être présenté comme le transgène et une petite quantité d'enzyme de restriction. Lors d'une réaction très court, extrait d'oeuf décondense partie de la chromatine des spermatozoïdes et l'enzyme de restriction génère cassures chromosomiques qui favorisent la recombinaison du transgène dans le génome. Les noyaux des spermatozoïdes traités sont ensuite transplantées dans les œufs non fécondés. L'intégration du transgène se produit habituellement avant le premier clivage embryonnaire tels que les embryons qui en résultent ne sont pas chimériques. Ces embryons peuvent être analysées sans qu'il soit nécessaire de se reproduire à la prochaine génération, permettant la génération rapide et efficace des embryons transgéniques pour des analyses de promoteur et de la fonction des gènes. Adulte X. laevis résultant de cette procédure également propager le transgène dans la lignée germinale et peut être utilisé pour générer des lignées d'animaux transgéniques à des fins multiples.

Protocole

Des versions modifiées de cette approche de transgenèse ont été initialement décrites en ¹ et ^2.

A. Préparation des noyaux de sperme

Cette méthode de préparation des noyaux est adapté de Murray ^3, mais les inhibiteurs de protéase ont été omises car elles interfèrent avec le développement ultérieur des œufs transplantés avec des noyaux de spermatozoïdes. Des aliquotes sont congelés à -80 ° C et peuvent être utilisés pour des transplantations d'environ 6 mois.

Toutes les solutions doivent être préparées et placées sur la glace avant le début de la préparation.

1. Anesthetize 1-2 mâle adulte X. laevis par immersion dans tricaïne pendant au moins 20 min suivie du jonchage; retirer les testicules.
2. Rouler les testicules sur une serviette en papier pour enlever le sang, les vaisseaux sanguins et de graisse du corps, lavez-les brièvement dans un plat de 60 mm de Petri contenant 1XMMR, et enlever toute pièce supplémentaire de la graisse corporelle. Prenez soin de ne pas percer les testicules, car cela libère le sperme.
3. Transfert des testicules à une sèche de 60 mm boîte de Pétri et laisser macérer des testicules avec des pinces jusqu'à ce qu'il n'y morceaux visibles. La macération doit être fait de manière aussi approfondie que possible afin d'obtenir des rendements élevés de noyaux.
4. Ajouter 2mls tampon froid préparation nucléaire (CNLC; 1X de stock) pour le macérat et doucement la pipette de haut en bas.
5. Squirt macérer dans environ 4 épaisseurs de gaze sur un entonnoir, recueillant dans un tube de 15 ml (par exemple Falcon 2059); Rincez plat avec 8mLs de la CNLC et de mettre ce rinçage à travers la gaze, en la recueillant dans le tube. Avec les mains gantées presser le fromage pour recueillir le liquide restant dans le tube.
6. Pellet le sperme à 3000 rpm pendant 10 min. à 4 ° C dans un rotor swing (1480g par exemple dans un Sorvall HB-rotor 4 ou équivalent) avec les adaptateurs de tube approprié. Décanter le surnageant, ajouter 8 ml CNLC à ce tube et la pipette de haut en bas avec une pipette de 10 mL à Resuspendre le culot; Isoler à nouveau comme ci-dessus et décanter le surnageant. Equilibrer 1mL de la CNLC à température ambiante pendant la rotation.
7. Resuspendre le culot dans 1 ml CNLC température ambiante en utilisant une pointe de 1 mL pipetteman, ajouter 50 pl de la lysolécithine 10mg/ml fraîchement préparé, mélangez délicatement et incuber pendant 5 min. à température ambiante.
8. Ajouter 10 ml de BSA à froid 1XNPB 3% sur le tube pour arrêter la réaction lysolécithine, mélanger délicatement et spin bas pendant 10 min à 3000 rpm dans un rotor swing. Décanter le surnageant. Le culot lysolécithine traité devrait ressembler un peu plus translucide (moins opaque blanc) qu'il a fait avant le traitement lysolécithine.
9. Décanter le surnageant et remettre le culot dans 5 ml de BSA à froid CNLC 0.3%, mélanger délicatement avec une pipette de 10 ml et centrifuger pendant 10 min à 3000rpm comme ci-dessus.
10. Décanter le surnageant et remettre le culot dans 500μl de tampon de stockage du sperme et le transfert d'un tube de 1,5 ml. C'est maintenant votre stock noyaux. Store sur la glace pendant que vous vérifiez le rendement de noyaux.
11. Pour vérifier le rendement des noyaux, placer 98 ul de tampon de dilution du sperme (PSD), 1 pl du stock nucléaire et 1 microlitre de 1:100 dilution du stock de Hoechst dans un tube Eppendorf de 1,5 ml. Mélanger le bouillon nucléaires très bien à l'aide d'un rasoir-coupées (ou grande ouverture) pointe de la pipette juste avant d'enlever l'ul 1. Mélanger la dilution SDB / Hoechst / noyaux très bien et laissez une petite quantité de s'écouler dans la chambre d'un hématimètre de Neubauer améliorée par capillarité. Comptez noyaux dans un carré de l'hématimètre sous un microscope composé. D'un homme, vous devriez obtenir le nombre d'au moins 100-200 (X10 ⁴ cellules / mL) pour cette dilution 1:100 du stock pour une concentration d'actions non dilué de 1-2X10 ⁵ cellules / ul. Si votre stock est moins concentré, laissez les noyaux se contenter de quelques heures, retirer certaines de surnageant, et de raconter. Laisser les noyaux à 4 ° C pendant la nuit pour permettre à la glycérine pour pénétrer pour mieux la cryoconservation, puis mélanger le matériel nucléaire bien avec une pointe de pipette large orifice, de préparer des aliquotes 20 pi, et congeler dans l'azote liquide.

B. Préparation de l'extrait de High Speed

Cette méthode est adaptée de Murray ^trois et produit un extrait cytosolique interphase qui favoriseront décondensation chromatine enflure et partielle des noyaux de spermatozoïdes ajouté. Extrait peuvent être congelés en petits aliquots à -80 ° C et décongelés avant utilisation.

1. 3-5 jours avant l'injection de HCG, le Premier 8-12 femelle adulte X. laevis en injectant 50 U de PMSG dans le sac lymphatique dorsal. Le soir, avant la préparation d'extraire, d'injecter chaque grenouille avec 500 unités HCG et placer 2 grenouilles / conteneur en 2 1XMMR litres. Comme une grenouille avec lyse ou l'activation des œufs peuvent compromettre la préparation d'extrait, il est conseillé de séparer les grenouilles en paires pour l'ovulation.
2. Le lendemain matin, préparer et réfrigérer toutes les solutions avant de commencer la préparation. Doucement, la main d'expulser les oeufs de chaque grenouille dans de grandes beakers contenant 1X ROR. Screen les oeufs de chaque conteneur et omettre tous les lots d'œufs avec des signes de marbrures, lyse ou l'activation (visualisé par la contraction de la pigmentation dans l'hémisphère animal) de la procédure. Collecter les œufs ininterrompue, même avec la pigmentation. Bonne oeufs peuvent aussi être collectées à partir du ROR 1X dans les seaux de grenouille. Le volume total d'œufs doit être> 100 ml de les 8-12 femelles.
3. De la gelée des oeufs. Pour ce faire, retirez ROR autant que possible, ajoutez une petite quantité de solution de cystéine, et faire tournoyer les œufs. Remplacer avec une solution de cystéine frais à plusieurs reprises pendant de-gélifiant. De la gelée de chaque lot d'œufs séparément et jetez lots avec la rupture ou l'activation d'oeuf. Combinez le reste des oeufs.
4. Laver les œufs à quatre reprises en ~ 35 mL de tampon de l'extrait (HB), puis deux fois dans 25 ml de LCR-XB avec des inhibiteurs de protéase.
5. Pour emballer les oeufs: transférer les oeufs dans des tubes ultraclear Beckman. Laisser les œufs à régler. Retirer autant CSF-XB que possible. Centrifuger les oeufs en utilisant un Beekman SW 40 Ti rotor (ou rotor similaire) à 1000 rpm (150g) pour ~ 60 sec à 4 ° C. Retirer l'excès de solution par le haut des oeufs emballés.
6. Pour écraser les oeufs et générer cytoplasmique extrait: centrifuger les oeufs à 10000 rpm (16.000 g) pendant 10 min à 4 ° C. Les œufs doivent se séparer en trois couches: des lipides (en haut), le cytoplasme (centre), et le jaune (en bas). Recueillir la couche cytoplasmique de chaque tube avec une aiguille de calibre 18 en insérant l'aiguille dans le tube à la base de la couche cytoplasmique. Transfert dans le cytoplasme d'un nouveau tube ultraclear Beckman sur la glace.
7. Ajouter les inhibiteurs de protéase dans le cytoplasme isolé à une concentration finale de 1X. Recentrifuger le cytoplasme à 16.000 g pendant 10 min à 4 ° C. Recueillir le cytoplasme clarifié comme décrit ci-dessus. S'attendre à obtenir de 0,75 à 1 cytoplasme mL / grenouille.
8. Ajouter 1 / 20 du volume extrait de mix énergétique à l'échantillon. Transfert du cytoplasme dans des tubes à paroi épaisse en polycarbonate pour la Beckman TL-100 ultracentrifugation. Tubes détiennent environ 3 ml chacun et doit être au moins à moitié plein.
9. Ajouter 1 M CaCl ₂ dans chaque tube à une concentration finale de 0,4 mM. Incuber les tubes pendant 15 min à température ambiante. Cette inactive LCR et pousse l'extrait dans l'interphase.
10. Équilibrer les tubes et les centrifugeuses dans un Beckman TL-100 en utilisant une ultracentrifugeuse TLA-100.3 rotor à 70000 rpm (200000 g) pendant 1,5 h à 4 ° C. Le cytoplasme se fractionnent en quatre couches, de haut en bas: des lipides, le cytosol, membrane / mitochondries, et le glycogène / ribosomes.
11. Retirez la couche cytosolique de chaque tube (~ 1 mL si 2-3 mL a été chargée dans le tube) en insérant une seringue dans le haut du tube à travers la couche lipidique. Transfert de la fraction cytosolique des tubes frais et recentrifuger les échantillons à 70 000 rpm (200 000 g) pendant 20 min à 4 ° C.
12. Aliquoter le surnageant dans 25 ul aliquotes dans des tubes de 0,5 mL. Quick-geler les aliquotes dans l'azote liquide et conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation. Afin de déterminer si l'extrait est efficace, les noyaux des spermatozoïdes peuvent être incubés dans l'extrait et colorés avec Hoechst pour déterminer si les noyaux visiblement houle (épaissir et allonger) dans les 10 min de plus à température ambiante.

Réaction de transgénèse C et le transfert nucléaire

Important: Vérifiez que les solutions, l'équipement et des grenouilles sont tous prêts avant le début d'une réaction. Une fois que vous commencez, vous devez procéder à la réaction en utilisant le calendrier approximatif décrit ci-dessous, car de nombreux éléments ne restent pas stables pendant> 30 minutes. Alors que le stock de noyaux de sperme est conservé sur la glace, les réactions de transgénèse (dilué et concentré) doit être conservé à température ambiante.

1. Premier grenouilles femelles. Le soir avant de transgénèse, injecter plusieurs (3-5) femelles adultes grenouille avec 800 unités HCG dans le sac lymphatique dorsal d'obtenir fraîchement oeufs pondus dès le lendemain.
2. Le jour de la procédure de la transgénèse, de préparer ou mettre à température les solutions nécessaires pour la transgénèse:
   1. Cystéine fraîchement préparé (2,5% en 1XMMR, pH 8,0). Vous aurez besoin de plusieurs centaines de millilitres d'être utilisés ce jour-là.
   2. Ficoll 0.2XMMR 6% pour les plats de la transplantation et la récupération des embryons transgéniques et 0.2XMMR 100 pg / ml de gentamicine (sans Ficoll) pour élever des embryons. Les solutions doivent pas être plus chaud que 18-21 ° C et d'embryons transgéniques doivent être soulevées par les clivages au début à des températures entre 16 et 21 ° C, car des températures plus élevées nuisent à la fois la fréquence de la transgénèse et le développement embryonnaire.
   3. Décongeler et s'équilibrer à température ambiante aliquotes congelés de la SDB (tampon de dilution du sperme) en vue de transplantations de la journée, le dégel de l'extrait à haute vitesse et placer sur la glace, et de préparer une _solution de MgCl2 100 mM.
   4. Sortez èmeplats d'injection électronique d'agarose et remplir avec MMR / Ficoll solution, et mis en place et de pré-lancer la pompe à perfusion afin de stabiliser le débit.
   5. Vérifiez que les grenouilles femelles pondent des oeufs et sont de haute qualité. Idéalement, les oeufs doivent avoir un cortex entreprise (tenir la forme, après de-gélifiant).
3. Mettre en place une réaction transgénèse:
   1. Très doucement (à l'aide d'une pipette épointés) mélanger les stocks des noyaux et de combiner dans un tube Eppendorf de 1,5 ml:
      Noyaux 4μl (~ 4-8X10 ⁵ noyaux)
      2μl plasmide linéarisé (100ng/μl)
      Incuber 5 minutes à température ambiante.
   2. tout d'incubation est de procéder, diluer 0.5μl d'enzyme de restriction dans 4.5μl H ₂ O et ajouter 1 microlitre d'enzyme diluée à 18μl du PSD, 2μl de MgCl ₂ et 2μl d'extrait à grande vitesse. Ajouter ce mélange à la réaction des noyaux-plasmide. Incuber 10 minutes de plus à gonfler les noyaux.
   3. Pendant cette incubation, presser les œufs de grenouilles et de 2 à 3 de la gelée dans une solution de cystéine. Lavez-les bien (5X) avec 1XMMR, et l'utilisation d'une pipette grand diamètre pour transférer 400 à 500 oeufs à chaque dejellied agarose contenant 0,2 x plat bien ROR Ficoll 4%. Cela prend habituellement environ 10 minutes, donc une fois les plats d'oeufs sont préparées de la réaction est généralement prêt à diluer.
   4. Environ 15-20 minutes après le début de l'étape a, mélanger délicatement la réaction (noyaux / / extrait l'ADN) avec une pointe coupée et ajouter environ 5uL à 150 PSD ul à température ambiante. Noyaux dans ce mélange dilué est stable pendant environ 1h., Alors qu'ils ne conservent pas la capacité de la transplantation tant quand on les laisse dans le mélange concentré.
4. Chargez l'aiguille: Mélanger la réaction diluée préparée ci-dessus très doucement avec une pipette large orifice, puis charger l'aiguille rapidement, comme des noyaux se déposent rapidement dans le tube. Pour backloading l'aiguille, placez un morceau de tuyau Tygon fine sur la fin d'un embout de pipette 200 pl coupés. Aspirer la solution dans l'embout de la pipette, puis fixez le tuyau à l'aiguille et laisser la solution d'entrer dans l'aiguille par gravité ou délicatement sur le piston pipette.
5. Fixer l'aiguille à la pompe tuyaux et commencent transplantations de noyaux. Les injections doivent être rapides, peu profondes et à peu près perpendiculaire à la membrane plasmique de l'œuf pour éviter de faire des dégâts. A la vitesse d'écoulement suggéré (10nl/sec), laisser l'aiguille dans l'œuf pour ~ 0,5 secondes. Vous devez compléter 1-2 plats de transplantations en 20-30 minutes.

Après les injections, laissez les plats à 16-20 ° C jusqu'à ce que les embryons ont atteint le stade de la cellule 4-8. Trier les embryons clivage loin de leur non-clivage voisins en transférant (avec une pipette Pasteur en verre avec une pointe à peu près le même diamètre que l'œuf) à un plat frais de Ficoll grande 0.2XMMR 4%. Subdiviser les embryons clivage en petits groupes (10-15 embryons / puits d'une plaque à 6 puits) et de la culture 0.2XMMR (pas de Ficoll) 100 mg / ml de gentamicine dans le développement précoce. Les embryons doivent être vérifiés pendant la gastrulation avec tout embryons meurent enlevé rapidement et les médias changé dès que nécessaire.

Dépannage:

1. Aiguille est bloquée: débit de la solution de l'aiguille doit être apparente au cours des transplantations. Si l'aiguille est bloquée par les particules visibles, le changement d'aiguilles ou d'essayer d'éliminer les débris par clipsage la pointe avec une pince et en poussant solution à travers l'aiguille.
2. Aucun clivage oeufs sont obtenus: vérifier que les dilutions des noyaux de spermatozoïdes et le volume d'injection sont appropriés et que l'aiguille n'a pas été bloquée pendant la transplantation. Si le volume d'injection est trop élevée, les œufs peuvent aussi ne pas cliver et de plutôt montrer la pigmentation décolorées ou des dommages.
3. Embryons Beaucoup meurent pendant la gastrulation. Plusieurs facteurs peuvent améliorer la survie des embryons:
   1. prendre soin avec les noyaux pendant la préparation et la réaction enzymatique. Noyaux décondensée sont fragiles et ont besoin d'être transplantés à l'aide du calendrier ci-dessus. Ne pas les placer sur la glace.
   2. Les altérations chromosomiques soutenue par les noyaux des spermatozoïdes lors de la réaction enzymatique et le transfert nucléaire affecte à la fois la fréquence de la transgénèse et le développement normal des embryons. Lésions chromosomiques dans les noyaux améliore l'efficacité de la transgénèse, mais affecte négativement la survie / développement normal. Diminuer ou en omettant d'enzyme de restriction pendant l'incubation enzyme peut améliorer le taux de développement normal, mais peut diminuer la fréquence de la transgénèse ou le nombre de copies du plasmide introduit dans le génome d'embryons.
   3. Si la fin de blastula travers embryons gastrula montrer des signes de décoloration ou de mort cellulaire, il est également possible que d'un réactif utilisé pour les transplantations était toxique pour les oeufs. En outre, si l'œufs n'ont pas un cortex cabinet, ils peuvent subir exogastrulation et ne parviennent pas à générer la normale après-gastrula embryons.
4. Le nombre d'embryons exprimant le transgène est faible. Augmenter la quantité d'enzyme de restriction.

Représentant Résultats embryon transgénique

Embryons transgéniques résultant des transferts nucléaires devrait être soulevée jusqu'à l'expression du promoteur d'intérêt est visible. Dans la figure 1 ci-dessus, un promoteur de l'actine musculaire entraîne l'expression de la protéine fluorescente verte dans les somites de ce têtard transgéniques.

Discussion

Pour chaque construction transgénique à être testé, nous avons généralement greffe noyaux dans les œufs 500-1000; à cette échelle, nous pouvons générer des embryons transgéniques exprimant jusqu'à 10 différentes constructions par jour, selon le nombre de femelles sont induits à pondre des oeufs. Parmi ces transplantations, environ un tiers de la cliver les œufs et 60-80% de ces embryons clivage passer par la gastrulation normalement. Selon les conditions de réaction utilisées, entre 10-50% de ces e...

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