Produção de transgênicos Xenopus laevis Por Restrição Integração Mediada por Enzima e Transplante Nuclear

Resumo

Este protocolo de vídeo demonstra um método para a geração de transgênicos Xenopus laevis Por introdução de transgenes em núcleos do esperma seguida de transplante nuclear em ovos não fertilizados.

Resumo

Integração estável dos produtos gene clonado no genoma Xenopus é necessário para controlar o tempo e lugar de expressão, para expressar genes em fases posteriores do desenvolvimento embrionário, e para definir como potenciadores e promotores de regular a expressão de genes no interior do embrião. O protocolo demonstrado aqui pode ser usado para produzir de forma eficiente embriões transgênicos Xenopus laevis. Esta abordagem transgenia envolve três partes: 1. Núcleos espermáticos são isolados do adulto X. testículo laevis pelo tratamento com lysolecithin, que permeabilizes da membrana plasmática de espermatozóides. 2. Extrato de ovo é preparado por centrifugação de baixa velocidade, além de cálcio para causar o extrato para avançar para a interfase do ciclo celular, e uma centrifugação de alta velocidade para isolar citosol interfase. 3. Nuclear transplante: os núcleos e extrato são combinados com o DNA do plasmídeo linearizado para ser apresentado como o transgene e uma pequena quantidade da enzima de restrição. Durante uma reação de curto, extrato de ovo parcialmente decondenses a cromatina de espermatozóides ea enzima de restrição gera quebras cromossômicas que promovem a recombinação do transgene no genoma. Os núcleos de espermatozóides tratados são então transplantados para ovos não fertilizados. Integração do transgene geralmente ocorre antes da primeira clivagem embrionária de tal forma que os embriões resultantes não são quiméricos. Esses embriões podem ser analisados ​​sem qualquer necessidade de raça para a próxima geração, permitindo a geração eficiente e rápida de embriões transgênicos para análises de promotor e função do gene. Adulto X. laevis resultante deste procedimento também propagar o transgene através da linha germinativa e pode ser usado para gerar linhas de animais transgénicos para fins múltiplos.

Protocolo

Versões modificadas deste abordagem transgênese foram inicialmente descritas em ¹ e ^2.

A. preparação núcleos do esperma

Este método de preparação núcleos é adaptado de Murray ^3, mas os inibidores da protease foram omitidos como elas interferem com o desenvolvimento subseqüente de ovos transplantado com núcleos de esperma. Alíquotas são congeladas a -80 ° C e podem ser usados ​​para transplantes por aproximadamente 6 meses.

Todas as soluções devem ser preparadas e colocadas no gelo antes de começar a preparação.

1. Anestesiar 1-2 adultos do sexo masculino X. laevis por imersão em tricaina por pelo menos 20 min seguido por mielotomia; remover os testículos.
2. Rolar os testículos em uma toalha de papel para remover o sangue, vasos sangüíneos e gordura corporal, lavá-los brevemente em uma placa de Petri contendo 60 milímetros 1XMMR, e remover quaisquer peças adicionais de gordura corporal. Tome cuidado para não furar os testículos, já que este libera o esperma.
3. Transferência testículos a uma placa de Petri e seco de 60 mm e testículos macerar com uma pinça até que não haja pedaços visíveis. Maceração deve ser feito tanto quanto possível para obter altos rendimentos de núcleos.
4. Adicionar tampão preparação 2mls frio nuclear (NPB; 1X de ações) para o macerado e gentilmente pipeta cima e para baixo.
5. Squirt macerar por cerca de quatro espessuras de gaze em um funil, a coleta em um tubo de 15 mL (Falcon por exemplo, 2059); Lavar prato com 8mLs do NPB e colocar este lavar através da gaze, recolhendo-a do tubo. Com as mãos enluvadas espremer a gaze para coletar líquido restante no tubo.
6. Pellet o esperma a 3.000 rpm por 10 min. a 4 ° C em um rotor de caçamba móvel (1480g por exemplo, em um rotor Sorvall HB-4 ou equivalente) com os adaptadores de tubo apropriada. NPB 8ml adicionar a este tubo e pipetar cima e para baixo com uma pipeta de 10 mL para ressuspender pellet;; sobrenadante decantar girar novamente como sobrenadante acima e decantar. Equilibrar 1mL de NPB à temperatura ambiente durante o spin.
7. Ressuspender pellet em 1mL NPB temperatura ambiente usando a 1 mL pipetteman ponta, adicionar 50μl de 10mg/mL lysolecithin preparados na hora, misture delicadamente e incubar por 5 min. à temperatura ambiente.
8. Adicionar 10 mL BSA 1XNPB frio +3% ao tubo para parar a reação lysolecithin, misture delicadamente, e spin down por 10 min a 3000 rpm em um rotor de caçamba móvel. Sobrenadante decantar. O pellet lysolecithin tratados deve olhar um pouco mais translúcido (branco opaco menos) do que tinha antes do tratamento lysolecithin.
9. Decantar o sobrenadante e ressuspender sedimento em 5 mL frio NPB BSA 0,3%, misture delicadamente com uma pipeta de 10 mL e spin down por 10 minutos a 3000rpm como acima.
10. Decantar o sobrenadante e ressuspender pellet em 500μl de tampão de espermatozóides de armazenamento e transferência para um tubo de 1,5 mL. Este é agora o seu estoque núcleos. Loja no gelo enquanto você verificar o rendimento dos núcleos.
11. Para verificar o rendimento dos núcleos, coloque 98 mL de tampão de diluição do esperma (SDB), 1 ml do estoque nuclear e 1μl de diluição 1:100 do estoque Hoechst em um tubo Eppendorf 1,5 ml. Misture o estoque nuclear muito bem usando um razor-cortada (ou grande abertura) ponteira pouco antes de retirar o mL 1. Misture a SDB diluído / Hoechst / núcleos muito bem e deixe uma pequena quantidade de fluxo para a câmara de um hemocitômetro de Neubauer melhorada por ação capilar. Contagem de núcleos em uma praça do hemocitômetro sob um microscópio composto. De um homem, você deve obter a contagem de pelo menos 100-200 (X10 ⁴ células / mL) para esta diluição de 1:100 do estoque para uma concentração de ações sem diluição de ^1-5 2X10 células / ml. Se o seu estoque é menos concentrada, vamos resolver os núcleos por várias horas, remover alguns dos sobrenadante, e recontagem. Deixe os núcleos a 4 ° C durante a noite para permitir que o glicerol para penetrar melhor para a criopreservação; em seguida, misture o estoque nuclear bem com um grande orifício da ponta da pipeta, prepare alíquotas 20μl, e congelar em nitrogênio líquido.

B. Elaboração de Extrato de Alta Velocidade

Este método é adaptado de Murray ³ e produz um extrato interfase citosólica que irá promover a descondensação da cromatina inchaço e parcial dos núcleos espermáticos acrescentou. Extrato pode ser congelada em pequenas alíquotas a -80 ° C e descongeladas antes de usar.

1. 3-5 dias antes da injeção de HCG, primeiro 12/08 fêmea adulta X. laevis pela injeção de 50 U de PMSG no saco linfático dorsal. A noite antes da preparação extrair, injetar cada sapo com 500 unidades HCG e coloque 2 rãs / recipiente em 2 1XMMR litros. Uma vez que um sapo com lise ou ativar os ovos podem comprometer a preparação do extracto, é conveniente separar as rãs em pares para a ovulação.
2. Na manhã seguinte, prepare e chill todas as soluções antes de iniciar a preparação. Suavemente, manualmente expulsar os ovos de cada sapo em grande beakers contendo 1X MMR. Tela os ovos em cada recipiente e omitir qualquer lotes de ovos com sinais de lise mottling, ou a activação (visualizada pela contração da pigmentação no hemisfério animal) do procedimento. Coleta de ovos ininterrupta, mesmo com a pigmentação. Ovos bons também podem ser coletados a partir do MMR 1X nos baldes sapo. O volume total de ovos deve ser> 100 mL da 8-12 fêmeas.
3. De-jelly os ovos. Para fazer isso, remova MMR, tanto quanto possível, adicione uma pequena quantidade de solução de cisteína, e agite os ovos. Substituir com solução de cisteína fresco várias vezes durante de-gelatinizante. De-geléia cada lote de ovos separadamente e descartar lotes com quebra ou a ativação do ovo. Combine o restante dos ovos.
4. Lave os ovos quatro vezes em 35 ~ mL de tampão extract (XB), e depois duas vezes em 25 mL de CSF-XB com os inibidores da protease.
5. Para embalar os ovos: transferência dos ovos em tubos de Beckman UltraClear. Permitir que os ovos para resolver. Remover o máximo CSF-XB possível. Centrifugar os ovos usando um Beckman SW 40 Ti rotor (rotor ou similar) a 1000 rpm (150g) de ~ 60 seg a 4 ° C. Retire o excesso de solução a partir do topo dos ovos embalados.
6. Para esmagar os ovos e gerar citoplasmática extrair: centrifugar os ovos em 10.000 rpm (16.000 g) por 10 min a 4 ° C. Os ovos devem separar em três camadas: lipídica (top), citoplasma (centro), e gema (parte inferior). Coletar a camada citoplasmática de cada tubo com uma agulha de calibre 18, inserindo a agulha através do tubo na base da camada de citoplasma. Transferência de citoplasma de um novo tubo de Beckman UltraClear no gelo.
7. Adicionar inibidores da protease para o citoplasma isolado para uma concentração final de 1X. Recentrifuge o citoplasma a 16.000 g por 10 min a 4 ° C. Recolher o citoplasma esclareceu como descrito acima. Esperam obter 0,75-1 citoplasma mL / sapo.
8. Adicione 1 / 20 do volume de extrato de mix de energia para a amostra. Transferência de citoplasma em tubos de paredes espessas de policarbonato para o TL-100 ultracentrífuga Beckman. Tubos de armazenar cerca de 3 mL cada um e deve ser pelo menos metade.
9. Adicionar 1 M CaCl ₂ a cada tubo a uma concentração final de 0,4 mM. Incubar os tubos durante 15 min à temperatura ambiente. Este inativa CSF e empurra o extrato em interfase.
10. Balanço dos tubos e centrifugar-los em um TL-100 ultracentrífuga Beckman usando um TLA-100,3 rotor em 70.000 rpm (200.000 g) por 1,5 horas a 4 ° C. O citoplasma se fracionar em quatro camadas, de cima para baixo: lipídico, citosol membrana, / mitocôndrias e glicogênio / ribossomos.
11. Remover a camada citosólica de cada tubo (~ 1 se mL 2-3 mL foi carregado para dentro do tubo) através da inserção de uma seringa no topo do tubo através da camada lipídica. Alienar a fração citosólica de tubos fresco e recentrifuge as amostras a 70.000 rpm (200.000 g) por 20 min a 4 ° C.
12. Alíquota do sobrenadante em 25 mL em alíquotas de 0,5 mL tubos. Quick-congelar as alíquotas em nitrogênio líquido e armazenar a -80 ° C até o uso. Para determinar se o extrato é eficaz, os núcleos do esperma pode ser incubadas no extrato e corados com Hoechst para determinar se os núcleos visivelmente swell (engrossar e alongar) dentro de 10 min da adição à temperatura ambiente.

C. reação Transgénese e transferência nuclear

Importante: Verifique se soluções, equipamentos e rãs estão todos prontos antes de começar uma reação. Uma vez que você começar, você deve proceder com a reação utilizando o calendário aproximado descrito a seguir, já que muitos componentes não permanecer estável por> 30 minutos. Enquanto o estoque núcleos do esperma é mantido em gelo, reações transgênese (ambos diluído e concentrado) deve ser mantido em temperatura ambiente.

1. Primeiro-rãs do sexo feminino. À noite antes de transgênese, vários injetar (3-5) sapo adulto do sexo feminino com 800 unidades de HCG no saco linfático dorsal para obter ovos frescos início no dia seguinte.
2. O dia do procedimento transgênese, preparar ou trazer a temperatura das soluções necessárias para a transgênese:
   1. Cisteína feita recentemente (2,5% em 1XMMR, pH8.0). Você vai precisar de várias centenas de mililitros para ser usado naquele dia.
   2. 0.2XMMR Ficoll 6% para os pratos de transplante e recuperação de embriões transgênicos e 0.2XMMR 100 mcg / mL de gentamicina (sem Ficoll) para a criação de embriões. Soluções não devem ser mais quente do que 18-21 ° C e embriões transgênicos devem ser levantados através de clivagens início a temperaturas entre 16 e 21 ° C, já que temperaturas mais altas afetar tanto a freqüência de transgênese e desenvolvimento embrionário.
   3. Descongelar e atingir a temperatura ambiente alíquotas congeladas de DRS (tampão de diluição do esperma) para transplantes do dia, descongelar o extrato de alta velocidade e colocar no gelo, e preparar um 100mM MgCl ₂ solução.
   4. Sair ªagarose e pratos de injeção e preencher com MMR / Ficoll solução, e configurar e executar o pré-bomba de infusão para estabilizar o fluxo.
   5. Verifique se as rãs do sexo feminino são poedeiras e ovos são de alta qualidade. Idealmente, os ovos devem ter um córtex empresa (manter a forma depois de-gelatinizante).
3. Configurar uma reação transgenia:
   1. Muito delicadamente (usando uma ponteira cortada) misturar o estoque núcleos e combinam em um tubo Eppendorf 1,5 ml:
      Núcleos 4μl (~ 4 ^8X10-5 núcleos)
      2μl linearizada plasmídeo (100ng/μl)
      Incubar 5 minutos à temperatura ambiente.
   2. enquanto processo de incubação é, diluir 0.5μl da enzima de restrição em 4.5μl H ₂ O e adicione 1μl da enzima diluída para 18μl da SDB, 2μl de MgCl ₂ e 2μl de extrato de alta velocidade. Adicione esta mistura para a reação de núcleos de plasmídeo. Incubar mais 10 minutos para inchar os núcleos.
   3. Durante esta incubação, squeeze ovos 2-3 sapos e geléia de-cisteína em solução. Lave-os bem (5x) com 1XMMR, e usar uma pipeta de largura deu a transferência de 400-500 ovos dejellied para cada prato bem agarose contendo 0,2 X Ficoll MMR 4%. Isso normalmente leva cerca de 10 minutos, então quando pratos de ovos são preparados a reação é geralmente pronto para diluir.
   4. Cerca de 15-20 minutos após o início do passo, misture delicadamente a reação (núcleos extrair / / DNA) com uma ponta cortada e adicionar cerca de 5μl a 150 SDB mL à temperatura ambiente. Núcleos nesta mistura diluída é estável por cerca de 1h., Enquanto eles não retêm a capacidade de transplante, desde quando saiu da mistura concentrada.
4. Carga a agulha: Misture a reação diluída, preparada acima muito delicadamente com uma ponta de largura orifício pipeta, em seguida, carregar a agulha rapidamente, como núcleos resolverão rapidamente no tubo. Para protelar o agulha, coloque um pedaço de tubo de Tygon bem no final de uma ponteira cortada 200μl. Desenhe a solução para a ponta da pipeta, em seguida, conectar o tubo à agulha e deixar a solução para inserir a agulha por gravidade ou levemente pressionando o êmbolo da pipeta.
5. Anexar agulha para começar a tubulação e bomba de transplantes de núcleos. Injecções devem ser rápidas, rasas e aproximadamente perpendicular à membrana do óvulo plasma para evitar fazer danos. A uma taxa de fluxo sugerido (10nl/sec), manter a agulha dentro do ovo para ~ 0,5 segundos. Você deve concluir 1-2 pratos de transplantes dentro de 20-30 minutos.

Após as injeções, deixe os pratos em 16-20 ° C até embriões atingiram o estágio de célula 4-8. Classificar os embriões cleaving longe de seus vizinhos não-clivagem, transferindo (com um copo de pipeta Pasteur com ponta de aproximadamente o mesmo diâmetro de um ovo) para um prato grande de doce 0.2XMMR Ficoll 4%. Subdividir a clivagem de embriões em grupos menores (10-15 embriões / poço de uma placa de 6 poços) e cultura em 0.2XMMR (sem Ficoll) 100 mcg / mL de gentamicina através do desenvolvimento precoce. Embriões devem ser verificados durante a gastrulação com qualquer embriões morrendo removidas imediatamente e os meios de comunicação mudado quando necessário.

Solução de problemas:

1. Agulha é bloqueado: fluxo de solução da agulha deve ser aparente durante os transplantes. Se a agulha for bloqueada por partículas visíveis, alterar agulhas ou tentar remover os destroços por corte a ponta com uma pinça e empurrando solução através da agulha.
2. Sem ovos clivagem são obtidos: verifique se diluições de núcleos de esperma e de volume de injeção são adequadas e que a agulha não foi bloqueado durante o transplante. Se o volume de injeção é muito alto, os ovos também podem não decompor e, em vez mostrar pigmentação descoloridos ou danos.
3. Embriões morrem durante a gastrulação. Vários fatores podem aumentar a sobrevivência embrionária:
   1. tomar cuidado com os núcleos durante a preparação ea reação enzimática. Núcleos descondensada são frágeis e precisam ser transplantados usando o calendário acima. Não colocá-los no gelo.
   2. O dano cromossômico sustentada pelos núcleos do esperma durante a reação enzimática e transferência nuclear afeta tanto a freqüência de transgênese e o desenvolvimento normal dos embriões. Danos cromossômicos para os núcleos aumenta a eficiência da transgenia, mas afeta negativamente a sobrevivência / desenvolvimento normal. Diminuindo ou omitindo enzima de restrição durante a incubação da enzima podem aumentar a taxa de desenvolvimento normal, mas pode diminuir a freqüência de transgênese ou número de cópias do plasmídeo introduzido no genoma do embrião.
   3. Se o atraso for blástula através de embriões gástrula mostrar sinais de descoloração ou morte celular, também é possível que um reagente utilizado para os transplantes era tóxico para os ovos. Além disso, se ovos não têm um córtex empresa, eles podem sofrer exogastrulation e não para gerar normais de pós-gástrula embriões.
4. O número de embriões expressando o transgene é baixa. Aumentar a quantidade de enzima de restrição.

Representante Transgênicos Resultados Embrião

Embriões transgênicos resultantes de transferências nuclear deve ser levantada até a expressão do promotor de interesse é visível. Na Figura 1 acima, um promotor de actina de músculo drives expressão da proteína verde fluorescente no somitos deste girino transgênicos.

Discussão

Para cada construção de transgênicos a serem testados, geralmente transplante de núcleos em 500-1000 ovos; nessa escala, podemos gerar embriões transgênicos expressando até 10 construções diferentes por dia, dependendo de quantas mulheres são induzidas a pôr ovos. Desses transplantes, cerca de um terço do cleave ovos e 60-80% destes embriões cleaving proceder através gastrulação normalmente. Dependendo das condições de reação utilizadas, entre 10-50% desses embriões expressar o transgene de interess...

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