Versões modificadas deste abordagem transgênese foram inicialmente descritas em 1 e 2.
A. preparação núcleos do esperma
Este método de preparação núcleos é adaptado de Murray 3, mas os inibidores da protease foram omitidos como elas interferem com o desenvolvimento subseqüente de ovos transplantado com núcleos de esperma. Alíquotas são congeladas a -80 ° C e podem ser usados para transplantes por aproximadamente 6 meses.
Todas as soluções devem ser preparadas e colocadas no gelo antes de começar a preparação.
- Anestesiar 1-2 adultos do sexo masculino X. laevis por imersão em tricaina por pelo menos 20 min seguido por mielotomia; remover os testículos.
- Rolar os testículos em uma toalha de papel para remover o sangue, vasos sangüíneos e gordura corporal, lavá-los brevemente em uma placa de Petri contendo 60 milímetros 1XMMR, e remover quaisquer peças adicionais de gordura corporal. Tome cuidado para não furar os testículos, já que este libera o esperma.
- Transferência testículos a uma placa de Petri e seco de 60 mm e testículos macerar com uma pinça até que não haja pedaços visíveis. Maceração deve ser feito tanto quanto possível para obter altos rendimentos de núcleos.
- Adicionar tampão preparação 2mls frio nuclear (NPB; 1X de ações) para o macerado e gentilmente pipeta cima e para baixo.
- Squirt macerar por cerca de quatro espessuras de gaze em um funil, a coleta em um tubo de 15 mL (Falcon por exemplo, 2059); Lavar prato com 8mLs do NPB e colocar este lavar através da gaze, recolhendo-a do tubo. Com as mãos enluvadas espremer a gaze para coletar líquido restante no tubo.
- Pellet o esperma a 3.000 rpm por 10 min. a 4 ° C em um rotor de caçamba móvel (1480g por exemplo, em um rotor Sorvall HB-4 ou equivalente) com os adaptadores de tubo apropriada. NPB 8ml adicionar a este tubo e pipetar cima e para baixo com uma pipeta de 10 mL para ressuspender pellet;; sobrenadante decantar girar novamente como sobrenadante acima e decantar. Equilibrar 1mL de NPB à temperatura ambiente durante o spin.
- Ressuspender pellet em 1mL NPB temperatura ambiente usando a 1 mL pipetteman ponta, adicionar 50μl de 10mg/mL lysolecithin preparados na hora, misture delicadamente e incubar por 5 min. à temperatura ambiente.
- Adicionar 10 mL BSA 1XNPB frio +3% ao tubo para parar a reação lysolecithin, misture delicadamente, e spin down por 10 min a 3000 rpm em um rotor de caçamba móvel. Sobrenadante decantar. O pellet lysolecithin tratados deve olhar um pouco mais translúcido (branco opaco menos) do que tinha antes do tratamento lysolecithin.
- Decantar o sobrenadante e ressuspender sedimento em 5 mL frio NPB BSA 0,3%, misture delicadamente com uma pipeta de 10 mL e spin down por 10 minutos a 3000rpm como acima.
- Decantar o sobrenadante e ressuspender pellet em 500μl de tampão de espermatozóides de armazenamento e transferência para um tubo de 1,5 mL. Este é agora o seu estoque núcleos. Loja no gelo enquanto você verificar o rendimento dos núcleos.
- Para verificar o rendimento dos núcleos, coloque 98 mL de tampão de diluição do esperma (SDB), 1 ml do estoque nuclear e 1μl de diluição 1:100 do estoque Hoechst em um tubo Eppendorf 1,5 ml. Misture o estoque nuclear muito bem usando um razor-cortada (ou grande abertura) ponteira pouco antes de retirar o mL 1. Misture a SDB diluído / Hoechst / núcleos muito bem e deixe uma pequena quantidade de fluxo para a câmara de um hemocitômetro de Neubauer melhorada por ação capilar. Contagem de núcleos em uma praça do hemocitômetro sob um microscópio composto. De um homem, você deve obter a contagem de pelo menos 100-200 (X10 4 células / mL) para esta diluição de 1:100 do estoque para uma concentração de ações sem diluição de 1-5 2X10 células / ml. Se o seu estoque é menos concentrada, vamos resolver os núcleos por várias horas, remover alguns dos sobrenadante, e recontagem. Deixe os núcleos a 4 ° C durante a noite para permitir que o glicerol para penetrar melhor para a criopreservação; em seguida, misture o estoque nuclear bem com um grande orifício da ponta da pipeta, prepare alíquotas 20μl, e congelar em nitrogênio líquido.
B. Elaboração de Extrato de Alta Velocidade
Este método é adaptado de Murray 3 e produz um extrato interfase citosólica que irá promover a descondensação da cromatina inchaço e parcial dos núcleos espermáticos acrescentou. Extrato pode ser congelada em pequenas alíquotas a -80 ° C e descongeladas antes de usar.
- 3-5 dias antes da injeção de HCG, primeiro 12/08 fêmea adulta X. laevis pela injeção de 50 U de PMSG no saco linfático dorsal. A noite antes da preparação extrair, injetar cada sapo com 500 unidades HCG e coloque 2 rãs / recipiente em 2 1XMMR litros. Uma vez que um sapo com lise ou ativar os ovos podem comprometer a preparação do extracto, é conveniente separar as rãs em pares para a ovulação.
- Na manhã seguinte, prepare e chill todas as soluções antes de iniciar a preparação. Suavemente, manualmente expulsar os ovos de cada sapo em grande beakers contendo 1X MMR. Tela os ovos em cada recipiente e omitir qualquer lotes de ovos com sinais de lise mottling, ou a activação (visualizada pela contração da pigmentação no hemisfério animal) do procedimento. Coleta de ovos ininterrupta, mesmo com a pigmentação. Ovos bons também podem ser coletados a partir do MMR 1X nos baldes sapo. O volume total de ovos deve ser> 100 mL da 8-12 fêmeas.
- De-jelly os ovos. Para fazer isso, remova MMR, tanto quanto possível, adicione uma pequena quantidade de solução de cisteína, e agite os ovos. Substituir com solução de cisteína fresco várias vezes durante de-gelatinizante. De-geléia cada lote de ovos separadamente e descartar lotes com quebra ou a ativação do ovo. Combine o restante dos ovos.
- Lave os ovos quatro vezes em 35 ~ mL de tampão extract (XB), e depois duas vezes em 25 mL de CSF-XB com os inibidores da protease.
- Para embalar os ovos: transferência dos ovos em tubos de Beckman UltraClear. Permitir que os ovos para resolver. Remover o máximo CSF-XB possível. Centrifugar os ovos usando um Beckman SW 40 Ti rotor (rotor ou similar) a 1000 rpm (150g) de ~ 60 seg a 4 ° C. Retire o excesso de solução a partir do topo dos ovos embalados.
- Para esmagar os ovos e gerar citoplasmática extrair: centrifugar os ovos em 10.000 rpm (16.000 g) por 10 min a 4 ° C. Os ovos devem separar em três camadas: lipídica (top), citoplasma (centro), e gema (parte inferior). Coletar a camada citoplasmática de cada tubo com uma agulha de calibre 18, inserindo a agulha através do tubo na base da camada de citoplasma. Transferência de citoplasma de um novo tubo de Beckman UltraClear no gelo.
- Adicionar inibidores da protease para o citoplasma isolado para uma concentração final de 1X. Recentrifuge o citoplasma a 16.000 g por 10 min a 4 ° C. Recolher o citoplasma esclareceu como descrito acima. Esperam obter 0,75-1 citoplasma mL / sapo.
- Adicione 1 / 20 do volume de extrato de mix de energia para a amostra. Transferência de citoplasma em tubos de paredes espessas de policarbonato para o TL-100 ultracentrífuga Beckman. Tubos de armazenar cerca de 3 mL cada um e deve ser pelo menos metade.
- Adicionar 1 M CaCl 2 a cada tubo a uma concentração final de 0,4 mM. Incubar os tubos durante 15 min à temperatura ambiente. Este inativa CSF e empurra o extrato em interfase.
- Balanço dos tubos e centrifugar-los em um TL-100 ultracentrífuga Beckman usando um TLA-100,3 rotor em 70.000 rpm (200.000 g) por 1,5 horas a 4 ° C. O citoplasma se fracionar em quatro camadas, de cima para baixo: lipídico, citosol membrana, / mitocôndrias e glicogênio / ribossomos.
- Remover a camada citosólica de cada tubo (~ 1 se mL 2-3 mL foi carregado para dentro do tubo) através da inserção de uma seringa no topo do tubo através da camada lipídica. Alienar a fração citosólica de tubos fresco e recentrifuge as amostras a 70.000 rpm (200.000 g) por 20 min a 4 ° C.
- Alíquota do sobrenadante em 25 mL em alíquotas de 0,5 mL tubos. Quick-congelar as alíquotas em nitrogênio líquido e armazenar a -80 ° C até o uso. Para determinar se o extrato é eficaz, os núcleos do esperma pode ser incubadas no extrato e corados com Hoechst para determinar se os núcleos visivelmente swell (engrossar e alongar) dentro de 10 min da adição à temperatura ambiente.
C. reação Transgénese e transferência nuclear
Importante: Verifique se soluções, equipamentos e rãs estão todos prontos antes de começar uma reação. Uma vez que você começar, você deve proceder com a reação utilizando o calendário aproximado descrito a seguir, já que muitos componentes não permanecer estável por> 30 minutos. Enquanto o estoque núcleos do esperma é mantido em gelo, reações transgênese (ambos diluído e concentrado) deve ser mantido em temperatura ambiente.
- Primeiro-rãs do sexo feminino. À noite antes de transgênese, vários injetar (3-5) sapo adulto do sexo feminino com 800 unidades de HCG no saco linfático dorsal para obter ovos frescos início no dia seguinte.
- O dia do procedimento transgênese, preparar ou trazer a temperatura das soluções necessárias para a transgênese:
- Cisteína feita recentemente (2,5% em 1XMMR, pH8.0). Você vai precisar de várias centenas de mililitros para ser usado naquele dia.
- 0.2XMMR Ficoll 6% para os pratos de transplante e recuperação de embriões transgênicos e 0.2XMMR 100 mcg / mL de gentamicina (sem Ficoll) para a criação de embriões. Soluções não devem ser mais quente do que 18-21 ° C e embriões transgênicos devem ser levantados através de clivagens início a temperaturas entre 16 e 21 ° C, já que temperaturas mais altas afetar tanto a freqüência de transgênese e desenvolvimento embrionário.
- Descongelar e atingir a temperatura ambiente alíquotas congeladas de DRS (tampão de diluição do esperma) para transplantes do dia, descongelar o extrato de alta velocidade e colocar no gelo, e preparar um 100mM MgCl 2 solução.
- Sair ªagarose e pratos de injeção e preencher com MMR / Ficoll solução, e configurar e executar o pré-bomba de infusão para estabilizar o fluxo.
- Verifique se as rãs do sexo feminino são poedeiras e ovos são de alta qualidade. Idealmente, os ovos devem ter um córtex empresa (manter a forma depois de-gelatinizante).
- Configurar uma reação transgenia:
- Muito delicadamente (usando uma ponteira cortada) misturar o estoque núcleos e combinam em um tubo Eppendorf 1,5 ml:
Núcleos 4μl (~ 4 8X10-5 núcleos)
2μl linearizada plasmídeo (100ng/μl)
Incubar 5 minutos à temperatura ambiente. - enquanto processo de incubação é, diluir 0.5μl da enzima de restrição em 4.5μl H 2 O e adicione 1μl da enzima diluída para 18μl da SDB, 2μl de MgCl 2 e 2μl de extrato de alta velocidade. Adicione esta mistura para a reação de núcleos de plasmídeo. Incubar mais 10 minutos para inchar os núcleos.
- Durante esta incubação, squeeze ovos 2-3 sapos e geléia de-cisteína em solução. Lave-os bem (5x) com 1XMMR, e usar uma pipeta de largura deu a transferência de 400-500 ovos dejellied para cada prato bem agarose contendo 0,2 X Ficoll MMR 4%. Isso normalmente leva cerca de 10 minutos, então quando pratos de ovos são preparados a reação é geralmente pronto para diluir.
- Cerca de 15-20 minutos após o início do passo, misture delicadamente a reação (núcleos extrair / / DNA) com uma ponta cortada e adicionar cerca de 5μl a 150 SDB mL à temperatura ambiente. Núcleos nesta mistura diluída é estável por cerca de 1h., Enquanto eles não retêm a capacidade de transplante, desde quando saiu da mistura concentrada.
- Carga a agulha: Misture a reação diluída, preparada acima muito delicadamente com uma ponta de largura orifício pipeta, em seguida, carregar a agulha rapidamente, como núcleos resolverão rapidamente no tubo. Para protelar o agulha, coloque um pedaço de tubo de Tygon bem no final de uma ponteira cortada 200μl. Desenhe a solução para a ponta da pipeta, em seguida, conectar o tubo à agulha e deixar a solução para inserir a agulha por gravidade ou levemente pressionando o êmbolo da pipeta.
- Anexar agulha para começar a tubulação e bomba de transplantes de núcleos. Injecções devem ser rápidas, rasas e aproximadamente perpendicular à membrana do óvulo plasma para evitar fazer danos. A uma taxa de fluxo sugerido (10nl/sec), manter a agulha dentro do ovo para ~ 0,5 segundos. Você deve concluir 1-2 pratos de transplantes dentro de 20-30 minutos.
Após as injeções, deixe os pratos em 16-20 ° C até embriões atingiram o estágio de célula 4-8. Classificar os embriões cleaving longe de seus vizinhos não-clivagem, transferindo (com um copo de pipeta Pasteur com ponta de aproximadamente o mesmo diâmetro de um ovo) para um prato grande de doce 0.2XMMR Ficoll 4%. Subdividir a clivagem de embriões em grupos menores (10-15 embriões / poço de uma placa de 6 poços) e cultura em 0.2XMMR (sem Ficoll) 100 mcg / mL de gentamicina através do desenvolvimento precoce. Embriões devem ser verificados durante a gastrulação com qualquer embriões morrendo removidas imediatamente e os meios de comunicação mudado quando necessário.
Solução de problemas:
- Agulha é bloqueado: fluxo de solução da agulha deve ser aparente durante os transplantes. Se a agulha for bloqueada por partículas visíveis, alterar agulhas ou tentar remover os destroços por corte a ponta com uma pinça e empurrando solução através da agulha.
- Sem ovos clivagem são obtidos: verifique se diluições de núcleos de esperma e de volume de injeção são adequadas e que a agulha não foi bloqueado durante o transplante. Se o volume de injeção é muito alto, os ovos também podem não decompor e, em vez mostrar pigmentação descoloridos ou danos.
- Embriões morrem durante a gastrulação. Vários fatores podem aumentar a sobrevivência embrionária:
- tomar cuidado com os núcleos durante a preparação ea reação enzimática. Núcleos descondensada são frágeis e precisam ser transplantados usando o calendário acima. Não colocá-los no gelo.
- O dano cromossômico sustentada pelos núcleos do esperma durante a reação enzimática e transferência nuclear afeta tanto a freqüência de transgênese e o desenvolvimento normal dos embriões. Danos cromossômicos para os núcleos aumenta a eficiência da transgenia, mas afeta negativamente a sobrevivência / desenvolvimento normal. Diminuindo ou omitindo enzima de restrição durante a incubação da enzima podem aumentar a taxa de desenvolvimento normal, mas pode diminuir a freqüência de transgênese ou número de cópias do plasmídeo introduzido no genoma do embrião.
- Se o atraso for blástula através de embriões gástrula mostrar sinais de descoloração ou morte celular, também é possível que um reagente utilizado para os transplantes era tóxico para os ovos. Além disso, se ovos não têm um córtex empresa, eles podem sofrer exogastrulation e não para gerar normais de pós-gástrula embriões.
- O número de embriões expressando o transgene é baixa. Aumentar a quantidade de enzima de restrição.
Representante Transgênicos Resultados Embrião

Embriões transgênicos resultantes de transferências nuclear deve ser levantada até a expressão do promotor de interesse é visível. Na Figura 1 acima, um promotor de actina de músculo drives expressão da proteína verde fluorescente no somitos deste girino transgênicos.