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Method Article
我々は、その後、表面抗原(DotScan CRCマイクロアレイ)を認識するカスタマイズされた抗体のマイクロアレイ上に捕捉されている実行可能な単一の細胞を、生成するために大腸癌(CRC)の分解のために手順を説明した。マイクロアレイに結合した細胞のサブ集団は、蛍光色素でタグ付けされたモノクローナル抗体を用いた蛍光多重化によってプロファイル化することができます。
CRCの現在の予後との分類は、病理組織学的および臨床所見を統合するシステムをステージングに依存しています。しかし、CRCのケースの大半で、細胞の機能不全は、蛋白質の発現と翻訳後修飾1を修正する多数の突然変異の結果である。
分化(CD)抗原のクラスターを含む細胞表面抗原、、の数は、CRCの潜在的な予後や転移性のバイオマーカーとして同定されている。これらの抗原は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)および腫瘍関連マクロファージ(TAMS)のような他の細胞型で腫瘍の進行や相互作用とその発現しばしば変更、として理想的なバイオマーカーを作る。
癌のサブ分類と予後のための免疫組織化学(IHC)の使用はいくつかの腫瘍タイプ2,3のために確立されます。しかし、単一の"マーカーは、"臨床病理病期分類よりも大きな予後的意義を示していないか、すべてのCRCケースのルーチン病理報告で使用するために広く受け入れられています。
疾患の表現型の予後の層別化により最近のアプローチは、複数の"マーカー"を使用して表面のタンパク質プロファイルに依存しています。 such iTRAQとしてproteomic手法を用いて腫瘍の発現プロファイリングがbiomarkers4の発見のための強力なツールですが、それは検査室で日常的に使用するための最適ではありません及び混合集団で異なる種類の細胞を区別することはできません。さらに、腫瘍組織の大量のこれらの方法によって精製の細胞膜糖タンパク質のプロファイリングに必要とされています。
このビデオでは、DotScan CRCの抗体のマイクロアレイを用いた非集計CRCのサンプルから生細胞の表面にプロテオームのプロファイリングのためのシンプルな方法を説明した。 122 -抗体のマイクロアレイは、CRCのための40潜在的に予後マーカーの検出のための衛星地域と一緒に、系統特異的白血球マーカー、接着分子、受容体と炎症と免疫応答5のマーカーの範囲を認識し、標準の82 -抗体の地域で構成されています。細胞は、それらが対応する抗原を発現するための抗体に捕捉されています。光学走査によって決定されるドットあたりの細胞密度は、その抗原を発現する細胞の割合は、抗体6の抗原と親和性の発現のレベルを反映している。
CRCの組織または正常な腸の粘膜の場合は、光学スキャンは、細胞の混合集団の免疫表現型を反映している。蛍光多重化は、アレイ上に捕捉された目的の細胞の選択したサブ集団をプロファイルするために使用することができます。例えば、アレクサ647 -抗上皮細胞接着分子(EpCAM、CD326)は、フィコエリスリン、抗CD3、使用されている間、、CRC細胞とまた正常な腸粘膜の上皮細胞を検出するために使用されたパン上皮分化抗原であるT -細胞7浸潤を検出する。 DotScan CRCマイクロアレイは、解剖学的にベースのCRCのステージングシステムへの診断の代替のためのプロトタイプにする必要があります。
CRCの手術標本からの生細胞の懸濁液の調製のための図1。作業の流れ。
1。臨床サンプルの分解
すべてのサンプルはプロトコルナンバーX08 - 164の下のインフォームドコンセントとロイヤルプリンスアルフレッド病院(キャンパー、NSW、オーストラリア)とコンコードの送還病院(コンコード西、NSW、オーストラリア)から採取された。
2。セルキャプチャ用のサンプル調製
3。抗体マイクロアレイのセルキャプチャ
4。多重蛍光
5。代表的な結果:
DotScanのマイクロアレイの結果から、重複して配列の間で一貫性のある細胞の結合パターンを示す必要があります。強力なアラインメントドット結合(CD44/CD29)は、配列の領域にわたって配置されるグリッドが可能になります。図2は、最適なセルのキャプチャと多重化の例を示しています。図3は、細胞の捕獲と考えられる解決中に発生するいくつかの一般的な問題を示しています。
マイクロアレイのセルの結合の結果は、1から256までgreynessの尺度で表現ドット強度を測定することによって定量することができます。図4は、階層的クラスタリングとヒートマップとしてEpCAM -アレクサ647抗体で染色した58外科CRCのサンプルから数値データを、示しています。サンプル数が限られているにもかかわらず、同じステージのCRCは同じグループ内のクラスタに傾向がある。
図2。臨床大腸癌の腫瘍(オーストラリアクリニック-病理学的病期分類、ACPステージB1)のセルの結合パターン。重複してマイクロアレイ(概説)の左半分のために抗体の位置を示す(A)DotScanの抗体のキー。上部のセクションでは、DotScan白血病のマイクロアレイのオリジナル82抗体が含まれています。特定の表面抗原に対応する追加40抗体は、CRC"衛星"マイクロアレイとして追加され、文献でアップレギュレートであることがわかった。下のセクションでは、アイソタイプコントロール抗体マイクロアレイへの結合CRC細胞の(b)光のイメージで構成されています。 T -細胞を示す(C)CD3蛍光画像。 CRC細胞を示す(d)はEpCAM蛍光イメージ。
図3。貧しいDotScan結果と可能な解決策の例。 (a)低細胞結合、解決策は:、:最小化するためにマイクロアレイ上でインキュベーションする前に、サンプルに熱不活化ヒトAB血清を追加するソリューション少なくとも4x106生存細胞は、(b)に結合アイソタイプコントロールのバインドと非特定のセルが配列上にあることを確認してくださいアイソタイプコントロールのバインド。時折、ニトロセルロースへの細胞の非特異的結合の少量は、CRCのサンプルで発生し、大きく結果には影響しません。 (C)ニトロセルロースは、インキュベーション中に乾燥、溶液:試料が全体のニトロセルロースのセクションをカバーし、マイクロアレイは、平らな表面上でインキュベートされていることを確認します。 (d)高バックグラウンドのアーティファクト。ソリューション:確認してくださいマイクロアレイは、徹底的に、以下のインキュベーションを洗浄する。
図4。DotScan解析ソフトウェアは、1から256までgreynessスケールでの細胞結合密度を表す棒グラフを生成した。軸上の数字は、CD抗原を参照してください。 κ、λ、免疫グロブリン軽鎖; SIG、表面免疫グロブリン、DCC、大腸癌の蛋白質で削除、EGFR、上皮成長因子受容体、FAP、線維芽細胞活性化タンパク質、HLA - A、B、他の略語は、TCR、T細胞受容体です。 、B、CをそれぞれC、HLA - DR、ヒト白血球抗原DRと、MICA、MHCクラスI鎖関連タンパク質、MMP - 14、行列のmetallopeptidase 14; PIGR、高分子免疫グロブリン受容体、TSP - 1、トロンボスポンジン-1;役割を持つ、ヒト化抗CD20。 拡大画像を表示するにはここをクリック 。
このビデオでは、我々はDotScan抗体のマイクロアレイは、CRCの組織からの細胞集団のために表面抗原のプロファイルを研究するために、単純な、半定量的な方法で使用することができる方法を示します。
エネルギー依存性のプロセス(例えば、キャッピング抗原および/または偽足形成が)、インキュベーション中の抗体のドットの全細胞の強固な結合に必要であるように...
利害の衝突は宣言されません。
我々は、CRCと正常な腸粘膜の新鮮なサンプルを収集するためのロイヤルプリンスアルフレッドとコンコードの送還病院の解剖学的病理学研究所のスタッフに感謝。仕事は癌研究所ニューサウスウェールズ州トランスレーショナルプログラムの助成金によって賄われていた。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
試薬や機器の名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
---|---|---|---|
ハンクス平衡塩類溶液 | シグマアルドリッチ | H6136 - 10X1L | 25mMのHEPES(シグマ#H3375)でバッファ |
Airpure生物学的安全キャビネットクラスII | ウェスティングハウス | 1687-2340/612 | |
外科ブレード | リビングストン | 090609 | 100枚入りパック |
2 mMのHEPESをRPMI 1640 | シグマアルドリッチ | R4130 - 10X1L | |
コラゲナーゼタイプ4 | ワージントン | 4188 | |
デオキシリボヌクレアーゼ1 | シグマアルドリッチ | DN25 - 1G | |
テルモシリンジ(10mL)を | テルモ | SS 10 L | 100のボックス |
Filconフィルター(200μm以下) | BDバイオサイエンス | 340615 | |
Filconフィルター(50ミクロン) | Filconフィルター(50ミクロン) | Filconフィルター(50μm)をFilconフィルター(50ミクロン)340603 | |
ウシ胎児血清 | GIBCO / Invitrogen社 | 10099-141 | |
5810 Rを遠心 | エッペンドルフ | 7017 | |
ジメチルスルホキシド | シグマアルドリッチ | D2650 | |
トリパンブルー | シグマアルドリッチ | T8154 | |
Hemocymeter Technocolor Neubar | ヒルシュマン | 利用できません | |
光顕微鏡 | ニコン | ニコンTMS | |
Cyrovialチューブ | グライナーバイオワン | 121278 | |
クライオ凍結contrainer | Nalgene | 5100-0001 | |
DotScan抗体マイクロアレイキット | Medsaic | 利用できません | |
DotScanマイクロアレイの洗浄トレイ | Medsaic | 利用できません | |
キムワイプ | キンバリークラーク | 4103 | |
37%ホルムアルデヒド | シグマアルドリッチ | F1635 - 500ML | |
DotReaderTM | Medsaic | 利用できません | |
ウシ血清アルブミン | シグマアルドリッチ | A9418 - 10G | |
熱不活化AB血清2パーセント | インビトロジェン | 34005100 | |
フィコエリスリン標識CD3 | ベックマンコールター | ET386 | |
AlexaFluor647 -共役EpCAM | BioLegend | 324212 | |
台風FLA 9000 | GEヘルスケア | 28-9558-08 | 532nmのレーザー、PEの580 BP30発光フィルター。 Alexa647のための633nmのレーザー、670 BP30発光フィルター |
複数実験ビューアv4.4の | TM4マイクロアレイソフトウェアスイート | オープン - ソースソフトウェア(文献11) |
The author's email has been corrected in the publication of Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing. There was an error with the author, Jerry Zhou's, email. The author's email has been updated to:
j.zhou@uws.edu.au
from:
jzho7551@mail.usyd.edu.au
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