マイクロCTイメージングのための準備として、逆行性灌流およびマウスの冠動脈血管系の充填

要約

冠状血管の可視化は、心血管疾患の我々の理解を進めることが重要です。ここでは、マイクロコンピューター断層撮影​​（μCT）イメージングの準備のために、放射線不透過性シリコーンゴム（Microfil）とマウス冠状動脈血管を灌流する方法を説明します。

要約

血管系の可視化は、さまざまな病気の状態を理解するためにますます重要になっています。いくつかの技術は、撮像血管系に存在するが、いくつかは、小型船^1,2が含まれ^てい^ます解像度を拡張しながら全体としての血管網を可視化することができます。さらに、多くの血管の鋳造技術は、サンプル^3-5のさらなる解析を防ぐために、周囲の組織を破壊する。これらの問題を回避する一つの方法は、マイクロコンピューター断層撮影​​（μCT）です。 μCTイメージングは、解像度が<10ミクロンでスキャンすることができます血管網の3次元再構成を作り出すことができるであり、その後の分析（例えば、組織学および形態計測^）6月11日のために無傷の組織を残します。しかし、ex vivoで μCT法によるイメージング血管は血管が放射線不透過性化合物で満たされている必要があります。このように、μCT画像によって生成された脈管構造の正確な表現は時に​​偶発的です。信頼性の高い容器の充填が完了しました。このプロトコルでは、我々は、μCT画像の準備のためにマウス冠状血管を充填するためのテクニックについて説明します。

二つの支配的なテクニックは、冠状動脈血管を埋めるために存在する：in vivoでの挿管とランゲンドルフ灌流システム^15から17を経由して大動脈（または大動脈弓から分岐^{）12から14、}またはex vivoでの逆行性血流を介して。ここでは、特にすべての船舶の充填を確認するように設計されている生体大動脈カニュレーション法で説明しています。我々は、すべての毛細血管だけでなく、血管網の動脈および静脈の両側を埋めるために、最小血管を灌流することができますMicrofilと呼ばれる低粘度の放射線不透過性化合物を使用しています。血管は加圧された灌流システムを用いた緩衝液で灌流し、Microfilで満たされている。そのMicrofilが小さい高抵抗血管を埋めるようにするために、我々は、大規模なブランチemanatinを連結coronariesにMicrofilをそらして大動脈からグラム。一度の充填には、いくつかの船のMicrofilを絞り出しから心臓組織の弾性の性質を防止するために、完了したら、我々はすぐに充填した後にアクセス可能な主要な血管の出口点を連結。動脈、毛細血管、静脈同様に - したがって、我々の手法は、完全な冠状血管網の可視化を可能にする、完全な充填および充填剤の最大保持のために最適化されています。

プロトコル

1。出発前の準備

1. それぞれ、血管拡張バッファー（PBS中4mgの/ Lのパパベリン+ 1グラム/ Lアデノシン）、またはPBS中4％パラホルムアルデヒド（PFA）で圧力灌流装置の各側面を埋める。
2. 1:100ヘパリン（5000U/mlストック）の0.1ミリリットルでそれを充填し、上ベベルと〜120度の角度に針を曲げて1/2ccインスリンシリンジ（恒久的に接続されている29Gと½ "針）を準備が増加します。 0.3ミリリットル飽和KCl溶液で満たされた1 mlのシリンジ（26G½ "針付き）と同じです。

2。心臓を露出し、大動脈をcannulating

1. 選択した麻酔薬を使用して、マウスを麻酔。 （私たちは、ケタミン/キシラジン混合物の過剰使用：130 mg / kgのケタミンと生理食塩水の8.8 mg / kgのキシラジンのIP注射）を
2. アップ解剖トレイ、腹側に麻酔マウスをピン。正中切開で腹腔を開き、皮膚を撤回臓器を公開します。後部下大静脈（PVC）の領域を露出させる一方の側に腸に移動します。
3. PVCにヘパリン溶液を注入します。あなたが針を抽出するように、漏れを防止し、PVC壁の血栓やアザラシまで数秒のためにそれを保持するために綿棒で針の穴をカバーしています。マウスの循環を通して分散させるためにヘパリン2-3分待ちます。
4. あなたは心臓の鼓動を観察することができるように横隔膜と胸郭を解剖。徐々に心臓の逮捕まで、PVCのKCl溶液を注入します。
5. ダイアフラムの領域前方をそのまま残し、ダイヤフラムと消費税マウスの後部の下にあるすべての臓器を削除します。心臓への近位部は、後続のステップで見つけることは容易であるので、絞りの近くにPVCを切断するように注意して、ダイヤフラムを取り外します。
6. 大動脈の切り口を探します。大動脈の下に6から0編組絹縫合糸の1つの長い長さ数ミリメートルあちこち前方に置きメートル縫合糸は、バック自体に倍増されるようにカット終了。大動脈下縫合の2個があるので、半分にこの長い縫合糸をカットします。大動脈（図1A、B）の切断端に血管カテーテルを挿入し、代わりに血管カテーテルを保持し、漏れから大動脈内の任意の背圧を防止するために、ダブルノットで各縫合糸を結ぶ。

3。血流とMicrofil注入

1. 圧力灌流装置（図2）に血管カテーテルを接続し、100から110 mmHgの運転圧力に灌流装置をポンプで血管拡張バッファ（図1C）で血管を灌流を開始します。バッファは、液体を確実にすることによって、coronariesを通して灌流されていることを確認しダブルは、PVCから終了します。少なくとも3分間、またはPVCを出る流体がクリアされるまで灌流し続けています。 （灌流しながら次のステップに進みます。）
2. リブとピンバック（または削除）心臓を露出させる胸郭を解剖。一度公開され、CAである心はガーゼのバッファーに浸漬した部分から心臓にバッファの滴を絞って乾燥させないreful。大動脈弓を公開するために胸腺を離れてオフにします。流体がcoronariesを通してではなく、これらの大きい、低抵抗血管（図1Dの）を介して流用されていることを確認するために6から0まで編んだシルク糸を使用して、3つの主要な大動脈の枝を連結。
3. 15分間固定して心臓を灌流し、少なくとも2分間血管拡張バッファーですすぎます。一方、注射後の心臓（図1E）の外に漏れるのMicrofilを防ぐために両方の前部静脈Cavaeを連結。場所は、PVCと大動脈周囲の縫合糸が充填後まで締めないでください。
4. Microfilを準備します（試薬の表で指定された）と1 mlの注射器にロードします。カテーテル（Microfilシリンジに潅流チューブから切り替えたときに気泡の導入を防ぐために）をカバーするのに十分な水で解剖トレイを記入してください。血apを切断カテーテルからparatusと準備Microfilシリンジを接続します。
5. 冠状動脈の良好な充填が（図1F、3A）明らかになるまで、大動脈にMicrofilを注入：動脈は、最初に記入し、その後MicrofilはMicrofilの色を持つ組織のフラッシュのように毛細血管に "流出"します。それは小型船から出てくるように一回静脈側では、Microfilの疎水性の性質は、それが最初に独立した球体として表示されます。連続した列が静脈を一杯になるまでMicrofilを注入し続けています。 Microfilは、血管内の連続であるときに完全な充填が明らかとなり、それがPVCを介して終了します。
6. 充填が完了した後、すぐに以前の船舶のうちMicrofilを絞ってから、心臓組織の弾性の性質を防止するためにPVCと大動脈の周囲に配置された縫合糸を締めます。
7. （解剖トレイから水に浸した濡れたガーゼで心臓をカバーMicrofilが重合されるまで）は、乾燥し、それが室温で約1時間放置を防ぐことができます。そのような心の奥に満ち船舶の早期ビューを取得しようとして心を持ち上げたり、回転などの重合プロセスの間、心臓の任意の外部からの圧力を避ける。これはMicrofilで改行を引き起こし、心のより弾性領域にいくつかの血管からMicrofilを絞ることができます。
8. 心臓を取り出して、4℃で一晩4％PFAでそれをポスト修正℃にその後、4℃、70％エタノールに保存心臓血管系は現在、μCTイメージングのための準備ができています。

4。代表的な結果

効果的にMicrofilで灌流されている船舶は、船舶全体の連続的な、切れ目のないMicrofil（図3A）を持ちます。冠状血管の充填の程度は、目で判断することができる。静脈epicardially ¹⁸に配置され、簡単に（図3A、矢印）が観察できます。動脈、これは^、18以上の心筋が、心臓の表面（図3A、矢印）からも見ることができます。心臓組織は、毛細血管の非常に高い密度を有し、したがって、ときに毛細血管塗りとしてキャピラリーフィリングにも明らかである、心臓の組織がMicrofilの色（図3A、スター）でフラッシュします。このように、埋めるために失敗した血管網が原因Microfilの欠如（図3B、C）に顕著になります。

Microfilの疎水性の性質は、それ自体に収縮充填容器内の "改行"を引き起こすことになりますので、Microfilの不連続性（図3Bのアスタリスク）が頻繁に表示されます。血管内の圧力は、心臓から血管の出口点の適切な提携オフを通して維持されている場合、これらの "改行"は削減することができます。他の不連続性がmicrofil内の気泡によって発生することができます。灌流APからの切り替え時の空気の導入を防ぐために、血管カテーテルが完全に水に沈めていることを確認してください Microfilシリンジにparatus。気泡が導入されている場合は、それはしばしばバブルが冠状血管の通って押し出されたまでMicrofil灌流を続けることによって、単に削除することができます。

血管床の一部が（図3B、矢印）がブロックされている場合、血管のネットワークは完全に埋めることはできません。ヘパリンは血栓の形成を阻害しながら、時折閉塞はまだ手順を開始する、またはその他の未知の要因に起因する前に起因する不完全なヘパリン血流に発生する可能性があります。閉塞が発生した場合は、血管の塗りつぶしを完了するには、閉塞を外れないための方法は、我々の知る限り、ありません。少なすぎる圧力はMicrofilは、すべての血管床と毛細血管網（図3C）に強制されないので、充填時に使用されている場合、不完全な充填にも発生する可能性があります。逆に、あまりにも多くの圧力が毛細血管周囲の組織（図3D）にMicrofilバーストと浸出する可能性があります。

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図1。 Microfil灌流スキームの概要 。 （A）大動脈とPVCは、ダイアフラムの約レベルでカットされます。 （B）上行大動脈は、血管カテーテルでカニューレ挿入されています。 （D）大動脈弓からの3つの主要な枝が連結されている間（C）血管拡張バッファは、（図示せず）の圧力灌流装置によって駆動され、血管を通って灌流されています。両方の前部静脈のカヴァが連結されている間（E）4％PFAはcoronariesを通して灌流されています。それは塩化ビニル（PVC）から出るが観察されるまで、（F）注射器を使用して、Microfilはcoronariesを通して灌流されています。

図2。灌流装置2つの三角フラスコ、血管拡張バッファまたは4％PFAのどちらかで満たされた各々が、参加し、彼らのsidearmsに接続されたチューブを介して加圧されています。システムは、ポンプマニュアルを加圧されているバルブ、圧力計、圧力のモニタリングとメンテナンスを可能にするためにフラスコのいずれかに接続されています。小さなチューブはゴム栓を介して上下に各フラスコ内の流体に拡張します。圧力はこれらの小さなチューブより各フラスコからsidearmsポンプ流体から入力します。チューブは、一度に1つのフラスコから流れるように流体ができます活栓にマージします。

図3。 Microfilled心をサンプリングします 。 （A）も満たされる船舶は、（もしあれば）Microfilで改行をいくつか持っているし、心臓組織はいっぱい毛細血管（スター、およびCと比較して）によるMicrofilの帯びた色になります。両方の動脈（矢印 - 左前下行枝）と静脈（矢印 - 左冠状静脈）は心臓の表面を介して表示されます。 （B）microfilで休憩（アスタリスク）と同様に完全にマイクを防止するいくつかの血管の閉塞による心浸透をrofil。ブロックされた血管は血液が灌流プロセス中にフラッシュされていないとして、赤（矢印）のままです。 （C）不完全に満たされた血管と心臓。組織がMicrofilが毛細血管に浸透しなかったことを示す、Microfilの黄色の色で撮影していないことに注意してください。 （D）心のどこMicrofilが周囲の組織（矢​​印）に漏れることを引き起こして、充填中の毛細血管が破裂。

ディスカッション

心臓組織は非常に高い代謝需要を持っているため、冠状血管系によって提供される血液から栄養と酸素の安定供給を必要とします。血管の狭窄や閉塞が原因で冠状動脈の機能を低下させる冠状血管の疾患は、組織低酸素および虚血につながると、心筋梗塞や心臓の筋肉への取り返しのつかない損傷の危険性が影響を受けた患者を置くことができます。これらの血管の病気の状態の理解が必要?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント
1 mlのシリンジ	ベクトン·ディッキンソン	BD-309602
恒久的に接続されている29G½ '針1/2ccインスリンシリンジ	ベクトン·ディッキンソン	BD-309306
2 "×2"ガーゼパッド	Med101store.com	SKU 2208
24G¾ "Angiocath IVカテーテル	ベクトン·ディッキンソン	BD-381112
26G½ "ゲージの針	痩せ細った ">ベクトン·ディッキンソン	BD-305111
アデノシン	シグマ	A9251	血管拡張バッファのPBSで1グラム/ L（パパベリン付）
斜めグレーフェ鉗子	ファイン科学ツール	11052から10
綿棒のアプリケーター：6 "非滅菌	カーディナルヘルス	C15055-006
湾曲した外科用はさみ	ファイン科学ツール	14085から09
解剖立体と光源	ニコン	NA	NA
解剖トレイ、29.2 x 7.5インチ	コール·パーマー	YO-10915から12	マウスを下に固定するためのタールで満たされた
ファイン曲がり鉗子	Aesculap	FD281R	必要がある2つの
ヘパリン、5000 U / mlストック	APPファーマシューティカルLLC	NDC 63323-047-10	水で100倍希釈
塩化カリウム	フィッシャー	P217	H2Oの飽和溶液
ケタミン（Ketaset）、100 mg / mlストック	フォートドッジ、オーバーランドパーク、カンザス州、アメリカ合衆国	NDC 0856-2013-01	0.9パーセントsのキシラジンで、130 mg / kg体重のように混合アリーン
Microfil	フローテック	MV-122（黄色）。他のカラーオプションも用意されています。	硬化剤の体積10％、重量比で1:1に混合します。それが十分に混合であることを確認するためだけに注入し、渦の前準備
非滅菌縫合糸：6-0、編んだシルク	ハーバード装置	723287
パパベリン	アメリカのリージェント株式会社	NDC 0517-4010-01	血管拡張バッファのPBS中4mgの/ L（アデノシン付）
パラホルムアルデヒド	シグマ	P6148	4％の溶液として調製し
灌流装置			図2を参照してください。
春のはさみ	ファイン科学ツール	15018から10
キシラジン（Anased）に20 mg / GL株式	ロイドラボ	NADA＃139から236	0.9％生理食塩水のケタミンで、8.8 mg / kg体重のように混合