それらの相互作用を研究する歯髄組織と癌細胞との共培養から間葉系幹細胞の分離

要約

歯髄由来間葉系幹細胞と共培養の直接的および間接的なメソッドに基づく前立腺癌細胞の相互作用の評価のためのプロトコルを提供します。条件中、トランスも膜間接傍分泌活動を分析に適しています。差動シードは直接細胞相互作用の適切なモデルを一緒に細胞を染色します。

要約

マルチ ステップ プロセスおよび複雑な病気としてのがんだけでなく個々 の細胞の増殖と成長によって規制がまた腫瘍環境と細胞間相互作用によって制御します。癌の幹細胞の相互作用、分泌因子、物理的相互作用、細胞外の環境の変化などの識別可能性があります新しい治療オプションの検出を有効にします。間葉系幹細胞 (MSCs) と癌のモデル系の細胞の相互作用を作成する知られている培養技術を組み合わせています。現在の研究では、直接および間接共培養法による歯髄幹細胞 (DPSCs) および PC 3 前立腺癌細胞の相互作用を調べた。条件培地 (CM) DPSCs から、傍分泌活動を研究する 0.4 μ m 孔サイズのトランスも膜が用いられます。一緒に異なる種類の細胞の共培養直接細胞間相互作用を検討しました。結果では、CM が細胞増殖を増加し、前立腺癌培養細胞のアポトーシスを減少したことを明らかにしました。CM とトランス ウェル システム PC 3 細胞の細胞遊走能を増加しました。同じ培養容器に細胞膜の染料で染色を播種、この直接培養条件下で PC 3 細胞の自己組織化構造の DPSCs が参加しました。全体的にみて、共培養技術でしたモデル システムとして癌と MSC の相互作用のために有用であることが示唆されました。

概要

分化と骨、軟骨、筋肉、靭帯、腱、脂肪などの間葉系組織の再生への貢献の能力を持つ幹細胞 (MSCs) は成人の体の¹のほとんどすべての組織から分離されています。^,2。 以外の慢性的な炎症やけがの場合細胞を生産することによって組織の恒常性を提供し、彼らは重要なサイトカインや血管新生、免疫システムと改造³組織を統制する成長因子を生成します。MSCs がん組織との相互作用がよく理解ではないが、蓄積された証拠は、MSCs が腫瘍発生・進行・転移⁴を促進するかもしれない示唆しています。

怪我や慢性的な炎症を起こしている領域に MSCs のホーミング能力は貴重な幹細胞ベースの治療対象となります。ただし、「決して傷を癒し」がん組織はまた炎症性サイトカイン、プロ血管新生の分子、cancerogenous エリア⁵に MSCs を引き付ける重要なの成長因子を解放します。限定があります⁷癌の進行および転移の促進作用が広くされている癌の成長^6,の MSCs の抑制効果を示すレポート⁸を報告しました。MSCs 直接的または間接的に影響を与える癌免疫細胞、癌細胞の増殖と血管新生促進活性を促進させると規制の移行をサポートする成長因子・ サイトカインの分泌を抑制するなどさまざまな方法で上皮間葉転換 (EMT)^9,10。癌関連付けられている線維芽細胞 (CAFs) や芽、血管内皮細胞、脂肪細胞、免疫細胞¹¹を含むいくつかの細胞型腫瘍環境が構成されます。これらのうち、CAFs は癌の増殖と転移⁸を促進各種ケモカインを分泌する腫瘍領域で最も豊富なセル型です。MSCs の骨髄由来腫瘍間質¹²CAFs で分化ができることが示されています。

Gronthosらによって最初の歯科組織由来 Msc として特徴付けられる歯髄幹細胞 (DPSCs)¹³ 2000 年に広く用いて他^14,15、 Oct4 Sox2, Nanogの¹⁶のような多能性マーカーを表現し、様々 な細胞 linages¹⁷に区別することができます。遺伝子やタンパク質の発現解析 DPSCs が血管内皮増殖因子 (VEGF)、アンジオジェニン、線維芽細胞成長因子 2 (FGF2)、インターロイキン 4 (IL-4) など他の MSCs を使用した成長因子・ サイトカインの対等なレベルを生成することを証明した IL 6, IL-10fms のようなチロシン キナーゼ 3 リガンド (フェルマーの最終定理-3 L) が血管新生を促進するため、免疫細胞を調節するサポートをがんと同様に、幹細胞因子 (SCF)、細胞増殖と移行^18,19,20.MSCs がん環境との相互作用は、文献でよくとり上げられるされている、DPSCs と癌細胞の関係はまだ評価されていません。本研究は, 歯科 MSCs がんの進展と転移のメカニズムの潜在的なアクションを提案する DPSCs、PC-3、転移性の高い前立腺癌細胞株の培養と条件の中治療戦略を設立しました。

プロトコル

患者の文書による同意は、機関の倫理委員会から承認後に得られました。

1. DPSC の分離と培養

1. 17 と完全なダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) を含む 20 に 15 mL チューブの間老化させて若い大人から得られる知恵の歯を転送 [低グルコース DMEM 培、10% 牛胎児血清 (FBS) と 1% ペニシリン/ストレプトマイシン地/アムホテリシン (PSA) ソリューション] 切除後 8 時間以内。潜在的な細胞死を避けるために転送中に冷たい組織材料 (4 ° C) をしてください。
2. 歯の中心から無菌抽出鉗子によって歯髄組織を慎重に削除、10 cm ティッシュの培養皿で冷たい完全 DMEM 培地にパルプのティッシュを置き、メスで小さな断片 (2-3 mm) にそれらをミンチします。
   注: すべての実験プロシージャが層流フードの無菌条件下で実施している必要があります。この非酵素的手法は、以前使用していた^21,22,23をされています。
3. 場所、組織培養内部組織の小さな果肉は 6 ウェル プレートを扱われ、それぞれの小さな果肉組織部分をカバーする完全な DMEM メディアの 200 μ L を追加します。
4. 組織性付着を提供する 2 時間 5% CO₂加湿空気の雰囲気 (湿度 80%) で 37 ° C で培養井戸を孵化させなさい。
   注: この手順は、メディアの蒸発を制御することにより 3 4 h に延長する可能性があります。
5. 井戸に完全 DMEM 培地の適切なボリューム (2 〜 2.5 mL) を追加し、37 ° c 5% CO₂の細胞のティッシュから広がり加湿空気中でインキュベートします。
   注: セル約 4 日後に見えるようになる、8-9 日後の confluency に到達します。
6. ときのセルでは、80% の confluency に到達、6 ウェル プレートからメディアを削除およびリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の 2 mL で洗い、トリプシンの 2 mL を加えます。加湿空気の雰囲気と 37 ° C でインキュベーターで 2 分と 5% CO₂間インキュベートします。トリプシンを阻害する 2 分で完全 DMEM 培地 2 mL を加えます。細胞のペレットに 5 分間、300 x g で細胞を遠心します。
7. 完全な DMEM メディアとのさらなる実験のための店でフラスコの通路セルです。1 つ T-75 フラスコ 6 ウェル プレートの 2 つの井戸から T-75 フラスコおよび転送細胞に完全な DMEM メディアの 15 mL を追加し、, 加湿空気の雰囲気と 5% CO₂の 37 ° C で。

2. DPSCs のキャラクタリゼーション

1. 形態素解析を実行します。
   1. 種子組織培養細胞 (ステップ 1.6) は、細胞の形態を観察する少なくとも 8 通路の完全 DMEM 培地のフラスコ (または 6 ウェル プレート) をコーティングしました。
   2. 顕微鏡で細胞を可視化し、線維芽細胞のような細胞の形態を定義します。細胞は培養皿に接続し、スピンドルのような細胞の形態がある必要があります。
      注: また、細胞が培養する単一セルとしての線維芽細胞と MSCs の特定の特徴であるコロニー形成能力を観察するウェル プレート最大 14 日間。
2. 表面マーカー解析を実行します。
   1. ステップ 1.7 から細胞を trypsinize します。T-75 組織培養用フラスコからメディアを削除、2 mL の PBS、洗って、トリプシンの 2 mL を加えます。加湿空気の雰囲気と 37 ° C でインキュベーターで 2 分と 5% CO₂間インキュベートします。トリプシンを阻害する 2 分で完全 DMEM 培地 2 mL を加えます。細胞のペレットに 5 分間、300 x g で細胞を遠心します。
   2. 1.5 mL チューブに室温で 20 分間 4% パラホルムアルデヒドとセルを修復して、500 μ L の PBS 3 回出し入れしてパラホルムアルデヒドで洗ってください。
   3. 100 μ L の PBS の 4 ° C で 1 時間抗体 (cd29)、CD34、CD14、CD45、CD90, CD105、CD166、CD73 と固定セルを孵化させなさい。
      注: 使用抗体濃度は 0.5 μ g/mL です。CD73、CD166、CD105 CD90 (cd29) は、MSCs の肯定的な細胞表面マーカーとして利用が、CD34、CD14、CD45 は否定辞として使用されます。
   4. 洗浄 3 回 PBS のセルおよびラベリングかに (FITC)、フィコエ リスリン (PE) などのそれぞれの二次抗体を使用します。1: 500 希釈した二次抗体 4 ° C で 30 分間 100 μ L の PBS のセル、PBS で 3 回洗浄を孵化させなさい。
   5. フローサイトメトリー解析のため暗闇の中のサンプルを保持し、正と負のフローサイトメトリーによる汚損を検出します。
      注: は、前方および側面の散布を手配するのに無染色制御の細胞を使用します。死んだ細胞、破片、および非染め色の人口を除外することによって集団をステンド グラスの積極的にゲートを配置します。45 psi シース圧 100 μ m ノズルを使用し、チャンネルを配置することによって肯定的な DPSCs を決定する 10,000 のイベントを収集します。
3. DPSCs の分化を実行します。
   1. 24 ウェル プレートに種子 1 × 10⁴セルは DMEM メディアを完了し、5% CO₂加湿空気の 37 ° C で 24 時間インキュベートします。
   2. 分化を定式化を使用してメディア対抗基本メディアとして DMEM 培地。100 nM デキサメタゾン、10 mM の β-グリセロリン酸 0.2 mM アスコルビン酸を混合することによって骨のメディアを準備します。1 × インスリン-トランスフェリン-セレン (ITS G)、100 nM デキサメタゾン、100 ng/mL トランスフォーミング成長因子 β (TGF-β)、14 μ g/mL アスコルビン酸、1 mg/mL ウシ血清アルブミン (BSA) を混合することによって軟骨メディアを準備します。60 μ M インドメタシン 0.5 mM 3-イソブチル-1-メチルキサンチン (IBMX)、5 μ g/mL インスリン 100 nM デキサメタゾンを混合することによって脂肪細胞のメディアを準備します。
      注: 分化メディアは 4 ° C で少なくとも 1 週間保存できます。
   3. 1 週間 2 回 2 週間骨、軟骨化生、または総アディポネクチン遺伝子分化メディアに成長の媒体および更新メディアを変更します。
   4. コッサによる分化を確認し、²¹が前述アルシアン青染色、酵素活性 (アルカリフォスファターゼ)、免疫細胞化学、およびプロトコルによると量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) 解析します。
      1. コッサを実行し、室温で 10 分間で 4% パラホルムアルデヒドで固定セルにアルシアン ブルー染色 PBS の固定セルを洗浄し、カルシウム沈着を観察するメーカーの推奨事項に従って vonKossa キットと、それらを染色.
      2. アルシアン青染色し、さらに染色の 3% (v/v) 酢酸 100 ml アルシアン ブルー色素の 1.00 g 溶解液を準備します。PBS の固定セルを洗浄し、アルシアン ブルー溶液で 30 分のための細胞を染色します。光顕微鏡による染色サンプルを視覚化します。

3. 条件媒体 (CM) の準備

1. CM コレクション前に新鮮な完全な DMEM 24 h 1.7 のステップからの細胞のメディアを交換してください。
   注: 2-4 の通路をお勧めします。
2. 電池が 80% の confluency に達するとき培養 DPSCs から条件培地 (CM) を収集します。収集したメディア廃棄物組織の材料と細胞の破片を削除する 5 分間 300 × g で遠心分離機します。
   注: また、がれき撤去作業中に 0.2 μ m シリンジ フィルターを使用します。
3. 上清を収集し、さらに実験のための-20 ° C で保存します。
   注: は、長期保存のための-80 ° C で上澄みを保持します。

4 cm の癌細胞の治療

1. 細胞生存率解析を実行します。
   1. シード PC 3 細胞 (ひと前立腺癌細胞) 5 × 10³細胞/ウェルでの細胞密度の 96 ウェル プレートに DMEM を完了し、24 h の CO₂を 37 ° C および 5% の加湿チャンバーで孵化させなさい。
   2. 10、20、30、40、および 50% (v/v) CM の 24 h の完全な DMEM に混合セルを扱います。
   3. 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxy-phenyl)-2-(4-sulfo-phenyl)-2H-tetrazolium による細胞生存率を (MTS) を測定-²⁴を前述のように測定します。
2. 遊離トランスフェラーゼ dUTP 端標識 (TUNEL) 解析を実行します。
   1. 6 ウェルの細胞培養プレート 2 × 10⁵の細胞密度で細胞/ウェルと 37 ° C および 5% CO₂で加湿チャンバーで一晩インキュベートにシード PC 3 セル。
   2. ミックス 20% (v/v) CM DMEM 培地を完了し、24 h のセルに適用。
   3. Trypsinize 細胞と TUNEL 反応混合物 (ソリューション + 酵素液、キットに付属のラベル) の 50 μ l を中断し、加湿と 5% CO₂雰囲気の中で 60 分の 37 ° C で孵化させなさい。
      注: trypsinization、6 も細胞培養皿からメディアを削除、1 mL の PBS で洗浄し、追加トリプシンを 500 μ l 添加します。加湿空気の雰囲気と 37 ° C でインキュベーターで 2 分と 5% CO₂間インキュベートします。トリプシンを阻害する 2 分で完全 DMEM 培地 1 mL を追加します。細胞のペレットに 5 分間、300 x g で細胞を遠心します。
   4. PBS で洗いし、フローサイトメトリーを使用して PBS のセルを分析します。
3. QPCR 分析を行います。
   1. 6 ウェルの細胞培養プレート 2 × 10⁵の細胞密度の細胞/ウェルと 37 ° C および 5% CO₂で加湿のインキュベーターで一晩インキュベートにシード PC 3 セル。
   2. ミックス 20% (v/v) CM DMEM 培地を完了し、24 h のセルに適用。
   3. Trypsinize 細胞 RNA の cDNA の分離と合成細胞ペレットを収集しています。
      注: 6 も細胞培養皿からメディアを削除、1 mL の PBS で洗浄、トリプシンの 500 μ L を追加します。加湿空気の雰囲気と 37 ° C でインキュベーターで 2 分と 5% CO₂を孵化させなさい。トリプシンを阻害する 2 分で完全 DMEM 培地 1 mL を追加します。細胞のペレットに 5 分間、300 x g で細胞を遠心します。
   4. 前述のプロトコル²⁵によると qPCR 実験を実行します。
4. 癌細胞の細胞移行を実行します。
   1. 種子 1 × 10⁵ PC 3 12 ウェル プレートの上に細胞し、37 ° C、5% CO₂で一晩加湿のインキュベーターで孵化させなさい。
   2. 滅菌 200 μ L チップと細胞を傷つけるし、CM の様々 な濃度を含む新鮮な培地ですぐに媒体を変更 [例えば10、20、30、40、および 50 %cm (v/v) 完全な DMEM に混合の]。
   3. 倒立顕微鏡下の傷を観察し、さまざまな時間間隔 (0 から 24 h) で写真を撮る。
   4. メジャー式を使用してイメージ J ソフトを用いたスクラッチの閉鎖:
      
      注: は、画像 J ソフトウェアとスクラッチのイメージを開きます。既にイメージに存在するスケール バーと同じ大きさのある線を描きます。クリックして分析し、縮尺を設定し、描画した線の倍率とのピクセル単位の距離を観察。既知の距離の部分にスケール バーのサイズを書いて、単位(ピクセル、cm 等)の手配、[ok] をクリックします。再度分析セクションに移動し、[測定] をクリックします。これは最初選択した単位としてスケール バーのサイズを与えます。最初の 1 つの端をクリックし、スクラッチのもう一方の端に到達するまでドラッグします。(0 h と 24 h) 各時点の値に注意してください。上記の式にこれらの値を接続し、傷の閉鎖を計算します。

5 がん細胞と DPSCs の間接的な接触でセル移行

1. シード 3 × 10⁴ DPSCs 0.4 μ m で 24 ウェル プレート挿入に毛穴し、37 ° C で一晩加湿のインキュベーターで孵化させなさい
2. 24 ウェルにシード PC 3 セルは 5 × 10⁴の細胞密度でプレートし、37 ° C、5% CO₂で一晩加湿のインキュベーターで孵化させなさい。
3. スクラッチ滅菌 200 μ L チップと PC 3 セル、新鮮な媒体、媒体を変更し、PC 3 細胞に DPSCs を運ぶ挿入を配置します。
4. 倒立顕微鏡下で細胞を観察し、細胞の移動を分析するさまざまな時間間隔 (0 から 24 h) で写真を撮る。

6. 共培養の試金とフローサイトメトリー解析の流れ

1. Pc-3 細胞および DPSCs PKH67 (緑) と PKH26 (赤) 蛍光細胞リンカー染料は、それぞれ²⁶を使用してラベルを付けます。
2. それぞれ PC 3 および DPSCs 細胞を trypsinize します。T-75 組織培養用フラスコからメディアを削除、2 mL の PBS、洗って、トリプシンの 2 mL を加えます。加湿空気の雰囲気と 37 ° C でインキュベーターで 2 分と 5% CO₂間インキュベートします。トリプシンを阻害する 2 分で完全 DMEM 培地 2 mL を追加します。
3. 5 分 300 x g で細胞を遠心、上清を破棄、キットによって提供される希釈剤 C バッファーで作製した色素溶液中の細胞ペレットを再懸濁します (材料の表を参照してください)。
4. 10 分間色素溶液中の細胞をインキュベートし、FBS の 100 μ L を追加することによって染色反応を終了します。5 分間 300 x g で細胞を遠心分離機、上澄みを廃棄し、完全培地で細胞を共培養する前に洗います。
5. 標識細胞プレート (5 × 104/ウェル) 1:1 の比率 (DPSCs: PC3) で 6 ウェル プレートの上に。完全な DMEM で共培養細胞を維持します。
6. 24 時間または 48 時間の潜伏期間の後 5 分、PBS で洗浄のための 300 x g で細胞の遠心分離によって細胞を収集します。
7. 300 μ L に 5 mL の丸底流れの cytometry チューブ (FACS) バッファーの並べ替え蛍光活性化細胞の細胞を再懸濁します。サンプル分析の前に、細胞凝集塊を分散する渦。
8. 45 psi シース圧 100 μ m ノズルを使用します。
   注: 非常に高い流動度蛍光検出の感度が低下可能性があります。
9. 適切な前方参照とセル型の補償、²⁷を前述の側散布レーザー電圧を調整するのに制御無染色の細胞と単一の着色されたセルを使用します。
   注: は、細胞の残骸、死んだ細胞、または集計除外するのに生きているセルのゲートを使用します。
10. フロリダ-1 (緑)、フロリダ州-2 (レッド) チャンネルを配置してパーセント肯定的な緑の DPSCs と赤い PC 3 セルを決定する (100,000 が望ましい) 10,000 のイベントを収集します。

結果

図 1は、培養条件下で DPSCs の一般的な MSC の特徴を示しています。DPSCs は、(図 1 b) めっき後線維芽細胞のような細胞の形態を発揮します。MSC 表面抗原 ((cd29)、CD73、CD90, CD105、および CD166)、造血のマーカー (CD34、CD45、CD14) 中高発現は負 (図 1)。形態学的および分子レベルで変化と骨 - 関係軟骨化生と裏...

ディスカッション

MSCs の腫瘍環境への貢献は、ハイブリッド細胞世代を介して細胞融合、幹細胞と癌細胞²⁸entosis またはサイトカインおよびケモカインの活動を含むいくつかの相互作用によって調整されます。構造、細胞間相互作用と分泌因子腫瘍促進、進行、および周囲の組織への転移癌細胞の動作を決定します。居住者の細胞集団の相互作用の背後にあるメカニズムを調査するモデ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	11885084	For cell culture
FBS	Invitrogen	16000044	For cell culture
PSA	Lonza	17-745E	For cell culture
Trypsin	Invitrogen	25200056	For cell dissociation
PBS	Invitrogen	10010023	For washes
Dexamethasone	Sigma	D4902	Component of differentiation media
β-Glycerophosphate	Sigma	G9422	Component of osteogenic differentiation medium
Ascorbic acid	Sigma	A4544	Component of osteo- and chondro-genic differentiation medium
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS −G)	Invitrogen	41400045	Component of chondrogenic differentiation medium
TGF-β	Sigma	SRP3171	Component of chondrogenic differentiation medium
Insulin	Sigma	I6634	Component of adipogenic differentiation medium
Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)	Sigma	I7018	Component of adipogenic differentiation medium
Indomethacin	Sigma	I7378	Component of adipogenic differentiation medium
MTS Reagent	Promega	G3582	Cell viability analyses
TUNEL Assay	Sigma	11684795910	Apoptotic analyses
24-well plate inserts	Corning	3396	For trans-well migration assay
PKH67	Sigma	PKH67GL	For co-culture cell staining
PKH26	Sigma	PKH26GL	For co-culture cell staining
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	For cell fixation
von Kossa Kit	BioOptica	04-170801.A	For cell staining (differentiation)
Alcian blue	Sigma	A2899	For cell staining (differentiation)