펄프 조직 문화와 공동 암 세포와 그들의 상호 작용을 공부 하에서 중간 엽 줄기 세포 분리

요약

우리 치과 펄프에서 격리 된 중간 엽 줄기 세포와 공동 문화를 직접 및 간접 방법에 따라 전립선 암 세포 상호 작용의 평가 대 한 프로토콜을 제공 합니다. 조건 매체 및 트랜스-잘 막 간접 paracrine 활동 분석에 적당 하다. 차동 시드 직접 셀 상호 작용에 대 한 적절 한 모델입니다 함께 셀 스테인드.

초록

다단계 프로세스와 복잡 한 질병으로 암은 개별 세포 증식 및 성장 뿐만 아니라 또한 종양 환경과 세포 세포 상호 작용에 의해 제어. 암 및 줄기 세포 상호 작용, 세포 외 환경, 물리적 상호 작용 및 분 비 요소에 변화를 포함 하 여 새로운 치료 옵션의 발견을 사용 수 있습니다. 우리는 시스템을 만들 모델 중간 엽 줄기 세포 (MSCs)와 암 세포 상호 작용 알려진된 공동 문화 기술을 결합 한다. 현재 연구에서 치과 펄프의 줄기 세포 (DPSCs) 및 PC 3 전립선 암 세포 상호 작용은 직접 및 간접 공동 문화 기술에 의해 시험 되었다. 조건 매체 (CM) DPSCs에서 얻은 고 0.4 µ m 기 공 크기의 트랜스-잘 막 paracrine 활동을 연구 하는 데 사용 했다. 다른 세포 유형의 공동 문화 함께 직접 셀 상호 작용을 연구 수행 되었다. 결과 공개 CM 세포 증식을 증가 하 고 전립선 암 세포 배양에 있는 apoptosis를 감소. CM 및 트랜스-잘 시스템 PC-3 셀의 셀 마이그레이션 용량을 증가 했다. 다른 막 염료와 스테인드 셀 같은 문화 혈관으로 시드 했다 고 DPSCs PC-3 셀이 직접 공동 문화 조건 자체 조직된 구조에 참가 했다. 전반적으로, 결과 표시 공동 문화 기술 모델 시스템으로 암 및 MSC 상호 작용에 대 한 도움이 될 수 있습니다.

서문

차별화와 같은 뼈, 연골, 근육, 인 대, 힘 줄, 그리고 지방, 간 엽 조직의 재생에 기여의 능력을 가진 중간 엽 줄기 세포 (MSCs),¹ 성인 신체에서 거의 모든 조직에서 분리 되어 ^{, 2}. 조직의 항상성 만성 염증 또는 상해 거주 셀을 생산 하 여 제공 하는, 다른 그들은 중요 한 cytokines 및 통합 하는 신생, 면역 체계, 그리고 조직³개장을 성장 요인 생산. 암 조직으로 MSCs의 상호 작용은 잘 이해 하지만 축적 증거 나왔다 MSCs가 종양 개시, 진행, 전이⁴를 홍보 수 있습니다.

부상 또는 만성 염증이 지역 MSCs의 귀환 능력은 그들이 줄기 세포 기반 요법에 대 한 귀중 한 후보. 그러나, 암 조직, "상처를 치유 하지", 또한 염증 성 cytokines, 프로-신생 분자, 그리고 cancerogenous 지역⁵MSCs를 유치 하는 중요 한 성장 요인 풀어. 그러나 거기에 제한⁷, 그들의 암 진행과 전이 홍보 효과 광범위 하 게 되어 암 성장^6,에 MSCs의 억제 효과 보여주는 보고서 보고⁸. MSCs 직접 또는 간접적으로 영향을 미칠 발암 억제 면역 세포, 암 세포 증식 및 마이그레이션, 신생 활동을 강화 하 고 규제를 지 원하는 성장 인자/cytokines를 은닉 하는 등 다른 방법으로 상피 엽 전환 (응급)^9,10. 암 관련 된 섬유 아 세포 (CAFs) 또는 myofibroblasts, 내 피 세포, adipocytes, 그리고 면역 세포¹¹을 포함 한 여러 세포 유형 종양 환경에 의하여 이루어져 있다. 그 중, CAFs는 암 성장과 전이⁸을 홍보 하는 다양 한 발산을 분 비 하는 종양 영역에서 가장 풍부한 셀 유형입니다. 그것은 종양 기질¹²골 파생 MSCs CAFs로 분화 할 수 표시 되었습니다.

치과 펄프의 줄기 세포는 (DPSCs), Gronthos 그 외 여러분 에 의해 첫 번째 치과 조직 파생 MSCs로 특징 2000 년에 ¹³ 널리^14,15다른 사람에 의해 조사, Oct4, Sox2및 Nanog¹⁶ 등 pluripotency 마커를 표현 하 고 다양 한 셀 linages¹⁷으로 분화 할 수 있다. 유전자와 단백질 표정 분석 입증 DPSCs 성장 인자/cytokines 혈관 내 피 성장 인자 (VEGF), angiogenin, 섬유 아 세포 성장 인자 2 (FGF2), 인터 루 킨-4 (IL-4), 다른 MSCs와 대 등 한 수준의 생산 일리노이-6, 일리노이-10, 그리고 줄기 세포 요소 (SCF), 뿐만 아니라 신생을 촉진, 면역 세포를 조절 하 고 암 세포 확산 및 마이그레이션^{18,19,20 지원 수 fms 같은 티로신 키 니 아 제 3 ligand (Flt-3 L)} . 동안 암 환경 상호작용 MSCs의 문학에서 문서화, DPSCs와 암 세포 사이 관계 아직 평가 하지는. 현재 연구에서 우리는 높은 전이성 전립선 암 세포 선, PC-3, 및 암 진행과 전이에 치과 MSCs의 메커니즘의 잠재적인 행동을 제안 하는 DPSCs에 대 한 공동 문화 및 상태 중간 치료 전략을 설립.

프로토콜

환자 서 면된 동의 기관 윤리 위원회에서 승인 후 얻은 것입니다.

1. DPSC 격리와 문화

1. 17 ~ 20 15 mL 튜브 포함 하는 완전 한 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 세 젊은 성인에서 얻은 사랑니 전송 [낮은 포도 당 DMEM 미디어, 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 페니실린/스 보충 / 암포 (PSA) 솔루션], 절제 후 8 시간 이내. 잠재적인 세포 죽음을 방지 하는 전송 하는 동안 조직 자료 감기 (4 ° C)를 보관.
2. 신중 하 게 치아의 중심에서 무 균 추출 겸 자 펄프 조직 제거, 펄프 조직 10cm 조직 문화 요리, 감기 완전 한 DMEM 매체에 놓고 메스로 작은 조각 (2-3 m m)으로 그들을 말하다.
   참고: 모든 실험 절차 수행 되어야 합니다 밖으로 층 류 후드에서 무 균 조건 하에서. 이 비 효소 기술 이전에 사용한^21,,2223되었습니다.
3. 내부 조직 문화 장소 작은 펄프 조직 6 잘 플레이트 취급 하 고 커버 각 작은 펄프 조직 조각에 완전 한 DMEM 미디어의 200 µ L를 추가 합니다.
4. 2 h 조직 첨부 파일을 제공 하기 위한 5% CO₂ 와 37 ° c 습도 공기 분위기 (80% 습도)에서 조직 문화 웰 스를 품 어.
   참고:이 단계 수 수 연장에 3-4 미디어의 증발을 조절 하 여.
5. 우물에 완전 한 DMEM 매체의 적절 한 볼륨 (2-2.5 mL)를 추가 하 고 조직에서 확산 하는 셀에 대 한 5% CO₂ 습도 공기 분위기에서 37 ° C에서 품 어.
   참고: 셀 약 4 일 후에 표시 되 고 8-9 일 후에 confluency를 도달.
6. 셀 80 %confluency 도달, 6 잘 플레이트에서 미디어를 제거 하 고 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 2 개 mL로 씻어 trypsin의 2 개 mL를 추가. 37 ° C 습도 공기 분위기에서 인큐베이터에 2 분 및 5% CO₂품 어. 트립 신 억제 하기 위해 부 화 2 분 뒤 완전 한 DMEM 매체의 2 개 mL를 추가 합니다. 셀 작은 셀을 5 분에 대 한 300 x g에서 원심
7. 완전 한 DMEM 미디어와 추가 실험에 대 한 저장소에 플라스 크를 통로 셀. 6 잘 플레이트 한 T-75 플라스 크에의 2 개의 우물에서 T-75 플라스 크 및 전송 셀 완전 한 DMEM 미디어의 15 mL를 추가 하 고 37 ° C 습도 공기 분위기와 5% CO₂에서 품 어.

2입니다. DPSCs의 특성

1. 형태소 분석을 수행 합니다.
   1. 씨 셀 (단계 1.6) 조직 문화에 플라스 크 (또는 6 잘 플레이트) 셀 형태를 관찰 하기 위해 적어도 8 구절에 대 한 완전 한 DMEM 매체에 코팅.
   2. 가벼운 현미경으로 세포를 시각화 하 고 구와 같은 셀 형태를 정의 합니다. 셀 문화 요리를 연결 하 고 스핀 들 모양의 세포 형태를가지고 해야 합니다.
      참고: 또는, 셀 수 수 경작 단일 셀으로 섬유 아 세포와 MSCs의 특정 특성은 식민지 형성 능력을 관찰을 잘 플레이트에 최대 14 일 동안.
2. 표면 마커 분석을 수행 합니다.
   1. 1.7 단계에서 셀 trypsinize T-75 조직 배양 플라스 크에서 미디어를 제거 하 고 PBS의 2 개 mL로 씻어 trypsin의 2 개 mL를 추가. 37 ° C 습도 공기 분위기에서 인큐베이터에 2 분 및 5% CO₂품 어. 트립 신 억제 하기 위해 부 화 2 분 뒤 완전 한 DMEM 매체의 2 개 mL를 추가 합니다. 셀 작은 셀을 5 분에 대 한 300 x g에서 원심
   2. 1.5 mL 튜브에 실 온에서 20 분 동안 4 %paraformaldehyde 셀을 수정 하 고 paraformaldehyde 제거 하려면 PBS 3 번 500 µ L로 그들을 씻어.
   3. PBS의 100 µ L에 4 ° C에서 1 시간을 위한 CD29, CD34, CD14, CD45, CD90, CD105, CD166, 및 CD73에 대 한 항 체와 고정된 셀을 품 어.
      참고: 사용 하는 항 체의 농도 0.5 µ g/mL. CD34, CD14, CD45 CD29, CD90, CD105, CD166, 및 CD73 MSCs에 대 한 긍정적인 세포 표면 표식으로 사용 하는 동안 부정적인 표식으로 사용 됩니다.
   4. 셀 3 회 PBS로 세척 하 고 fluorescein isothiocyanate (FITC), phycoerythrin (PE), 등 각각 2 차 항 체를 사용 하 여 라벨에 대 한. 4 ° C에서 30 분 PBS의 100 µ L에 희석 1: 500 2 차 항 체와 세포와 PBS로 3 회 세척을 품 어.
   5. 샘플 흐름 cytometry 분석을 위해 어둠 속에서 유지 하 고 긍정적이 고 부정적인 얼룩 cytometry에 의해 감지.
      참고: 앞으로 및 측면 분산형을 흠 없는 제어 셀을 사용 합니다. 죽은 세포, 파편, 및 유엔 스테인드 인구를 제외 하 여 인구 스테인드 게이팅의 긍정적으로 정렬 합니다. 45 psi 칼 집 압력 100 µ m 노즐을 사용 하 여 고 10000 이벤트 채널을 정렬 하 여 긍정적인 DPSCs 결정를 수집 합니다.
3. DPSCs의 차별화를 수행 합니다.
   1. 씨앗 1 × 10에 24-잘 접시에⁴ 셀 DMEM 미디어를 완료 하 고 5% CO₂습도 공기 분위기에서 37 ° C에서 24 h에 대 한 품 어.
   2. 차별화를 공식화 미디어를 사용 하 여 기본 미디어 DMEM 매체 경쟁. 100 nM dexamethasone, 10 m m β-glycerophosphate, 및 0.2 m m 의약품을 혼합 하 여 osteogenic 미디어를 준비 합니다. 혼합 하 여 1 × 인슐린-처리가-셀레늄 (ITS-G), 100 nM dexamethasone, 100 ng/mL 변형 시키는 성장 인자 beta (TGF-β), 의약품 14 μ g/mL, 1 mg/mL 소 혈 청 알 부 민 (BSA) chondrogenic 미디어를 준비 합니다. 100 nM dexamethasone, 5 μ g/mL 인슐린, 0.5 m m 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), 그리고 60 μ M indomethacin을 혼합 하 여 adipogenic 미디어를 준비 합니다.
      참고: 차별화 미디어 보관할 수 있습니다 4 ° C에 적어도 1 주일에 대 한.
   3. 2 주 동안 일주일에 두 번 osteo, chondro 또는 adipo genic 차별화 미디어 성장 매체 및 새로 고침 미디어를 변경 합니다.
   4. Von Kossa Alcian 블루 얼룩, 효소 활동 (알칼리 성 인산 가수분해 효소 활동), immunocytochemistry, 및 프로토콜 앞에서 설명한²¹에 따라 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량) 분석 하 여 차별화를 확인 합니다.
      1. Von Kossa 수행 하 고 Alcian 블루 stainings 10 분에 대 한 실 온에서 4 %paraformaldehyde 고정 된 셀에 PBS 가진 고정된 셀을 세척 하 고 칼슘 예금 관찰 하는 제조 업체의 권장 사항에 따라 vonKossa 키트와 함께 얼룩 .
      2. Alcian 블루 추가 얼룩에 대 한 3% (v/v) 초 산 100ml에 파란 Alcian 염료의 1.00 g을 용 해 하 여 솔루션 얼룩을 준비 합니다. PBS 가진 고정된 셀을 세척 하 고 30 분 Alcian 블루 솔루션에 대 한 셀을 얼룩. 가벼운 현미경에 의해 스테인드 샘플을 시각화.

3. 조건 매체 (CM)의 준비

1. CM 컬렉션 전에 신선한 완전 한 DMEM 24 h 단계 1.7에서에서 셀의 미디어를 바꿉니다.
   참고: 통로 2-4는 것이 좋습니다.
2. 셀 도달 80 %confluency 교양된 DPSCs에서 조건 매체 (CM)를 수집 합니다. 폐 조직 재료와 세포 파편을 제거 하 5 분에 대 한 300 x g에서 수집 된 미디어 원심
   참고: 또는, 조건 매체에서 파편을 제거 하려면 0.2 µ m 주사기 필터를 사용 합니다.
3. 상쾌한 수집 하 고 추가 실험-20 ° C에서 저장.
   참고: 장기 저장을 위한-80 ° C에는 상쾌한을 유지.

4입니다. CM와 암 세포의 치료

1. 세포 생존 능력 분석을 수행 합니다.
   1. 씨앗 PC-3 셀 (인간의 전립선 암 세포)의 5 × 10³ 셀/에 셀 밀도에서 96 잘 접시에 DMEM 고 24 h에 대 한 37 ° C, 5% CO₂ 습도 챔버에 품 어.
   2. 24 h에 대 한 완전 한 DMEM 혼합 10, 20, 30, 40, 및 CM (v/v)의 50%에 포함 된 셀을 취급 합니다.
   3. (MTS) 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxy-phenyl)-2-(4-sulfo-phenyl)-2H-tetrazolium를 사용 하 여 세포 생존 측정-²⁴이전에 설명 된 대로 시험.
2. 터미널 deoxynucleotidyl 전이 효소 dUTP 닉 끝 라벨 (TUNEL) 분석을 수행 합니다.
   1. 6 잘 세포 배양 접시 2 × 10⁵ 셀 밀도에 셀/잘와 하룻밤에 37 ° C, 5% CO₂ 습도 챔버에 품 어에 씨 PC-3 셀.
   2. 혼합 20%와 CM (v/v) DMEM 매체를 완료 하 고 24 시간에 대 한 셀에 적용 합니다.
   3. 셀 trypsinize TUNEL 반응 혼합물 (솔루션 + 효소 솔루션, 키트와 함께 제공 된 라벨)의 50 μ에 중단 하 고 습도 하 고 5% CO₂ 분위기에서 60 분 동안 37 ° C에서 품 어.
      참고: trypsinization에 대 한 6-잘 세포 배양 배지에서 미디어를 제거, 1 mL의 PBS로 세척 및 추가 500 µ L의 트립 신. 37 ° C 습도 공기 분위기에서 인큐베이터에 2 분 및 5% CO₂품 어. 트립 신 억제 하기 위해 부 화 2 분 뒤 완전 한 DMEM 매체의 1 mL를 추가 합니다. 셀 작은 셀을 5 분에 대 한 300 x g에서 원심
   4. PBS와 린스를 cytometry 사용 하 여 PBS에 세포를 분석 합니다.
3. 정량 분석을 수행 합니다.
   1. 6 잘 세포 배양 접시 2 × 10⁵ 셀 밀도에 셀/잘와 하룻밤에 37 ° C, 5% CO₂ 습도 인큐베이터에서 품 어에 씨 PC-3 셀.
   2. 혼합 20%와 CM (v/v) DMEM 매체를 완료 하 고 24 시간에 대 한 셀에 적용 합니다.
   3. Trypsinize 셀을 RNA 격리 및 cDNA 합성 펠 렛 셀을 수집 합니다.
      참고: 6 잘 세포 배양 배지에서 미디어를 제거 하 고 PBS의 1 mL로 씻어 trypsin의 500 µ L을 추가. 37 ° C 습도 공기 분위기에서 인큐베이터에 2 분, 5% CO₂를 품 어. 트립 신 억제 하기 위해 부 화 2 분 뒤 완전 한 DMEM 매체의 1 mL를 추가 합니다. 셀 작은 셀을 5 분에 대 한 300 x g에서 원심
   4. 앞에서 설명한 프로토콜²⁵에 따라 정량 실험 수행 합니다.
4. 암 세포의 세포 마이그레이션을 수행 합니다.
   1. 씨앗 1 × 10⁵ PC-3 12-잘 접시에 셀 하 고 37 ° C, 5% CO₂에서 하룻밤 습도 인큐베이터에서 품 어.
   2. 살 균 200 μ 팁 셀 긁 고 즉시 CM의 다양 한 농도 포함 하는 신선한 매체와 매체 변경 [예를 들어, 10, 20, 30, 40, 및 완전 한 DMEM 섞인 CM (v/v)의 50%].
   3. 거꾸로 현미경 흠집을 관찰 하 고 다른 시간 간격 (0, 24 h)에서 사진을 찍을.
   4. 수식을 사용 하 여 이미지 J 소프트웨어를 사용 하 여 스크래치 폐쇄를 측정:
      
      참고: 이미지 J 소프트웨어와 함께 스크래치 이미지를 엽니다. 눈금 막대는 이미지에 이미 있는 동일한 크기를 가진 선을 그립니다. 클릭 분석, 규모, 설정 하 고 그려진 선의 확대 픽셀에서 거리를 관찰. 알려진된 거리 부분에 눈금 막대의 크기를 작성, 단위 (픽셀, cm, 등), 배열 하 고 확인을 클릭 합니다. 분석 섹션에 다시가 고 측정 클릭. 이 먼저 선택한 단위로 눈금 막대의 크기를 줄 것 이다. 처음의 한 가장자리에 클릭 하 고 처음의 다른 쪽 끝을 도달할 때까지 끕니다. (오와 24 h) 각 시간 점의 값 note 위의 공식에 이러한 값을 연결 하 고 스크래치 폐쇄를 계산.

5. 암 세포와 DPSCs의 간접적인 접촉에 의해 셀 마이그레이션

1. 시드 3 × 10⁴ DPSCs 0.4 μ m와 24-잘 플레이트 삽입에 기 공 하 고 37 ° c.에 하룻밤 습도 인큐베이터에서 품 어
2. 씨 PC-3 셀에 24-잘 5 × 10⁴ 의 세포 조밀도에 플레이트 고 37 ° C, 5% CO₂에서 하룻밤 습도 인큐베이터에서 품 어.
3. 살 균 200 μ 팁 PC-3 셀 스크래치, 신선한 매체와 매체를 변경 하 고 삽입 PC-3 셀에 DPSCs를 들고 장소.
4. 거꾸로 현미경 세포를 관찰 하 고 셀 마이그레이션 분석을 다른 시간 간격 (0, 24 h)에서 사진을 찍을.

6. 공동 문화 분석 결과 및 Flow Cytometry 분석

1. PC-3 셀 및 DPSCs PKH67 (녹색) 및 PKH26 (적색) 형광 셀 링커 염료, 각각²⁶사용 하 여 레이블을 지정 합니다.
2. Trypsinize PC-3와 DPSCs 세포, 각각. T-75 조직 배양 플라스 크에서 미디어를 제거 하 고 PBS의 2 개 mL로 씻어 trypsin의 2 개 mL를 추가. 37 ° C 습도 공기 분위기에서 인큐베이터에 2 분 및 5% CO₂품 어. 트립 신 억제 하기 위해 부 화 2 분 뒤 완전 한 DMEM 매체의 2 개 mL를 추가 합니다.
3. 5 분 x 300g에 세포를 원심, 상쾌한, 삭제 및 셀 펠 릿 키트에서 제공 하는 희석제 C 버퍼에 염료 해결책에서 resuspend ( 재료의 표참조).
4. 10 분 동안 염료 용액에 세포를 품 어와 FBS의 100 µ L을 추가 하 여 착 색 반응 종료. 5 분 x 300g에 세포를 원심, 상쾌한, 삭제 하 고 공동 경작 하기 전에 완전 한 성장 매체를 가진 세포를 씻어.
5. 셀 표시 판 (5 × 104/잘) 1:1 비율로 (DPSCs: PC3) 6-잘 접시에. 완전 한 DMEM에 공동 경작된 한 세포를 유지 합니다.
6. 24 시간 또는 48 h 인큐베이션 기간 후 5 분 및 PBS로 세척에 대 한 300 x g에서 셀의 원심 분리에 의해 세포를 수집 합니다.
7. 300 µ L 하단 흐름 cytometry 튜브 라운드 5 ml에서 (FACS) 버퍼를 정렬 하는 형광 활성화 셀의 셀 resuspend 샘플 분석 전에 오른쪽 셀 집계를 분산 소용돌이.
8. 45 psi 칼 집 압력 100 µ m 노즐을 사용 합니다.
   참고: 매우 높은 유량 형광 검출의 감도 줄일 수 있습니다.
9. 흠 없는 컨트롤 셀과 단일 색된 셀 사용 하 여 적절 한 앞으로 세포 유형 및 보상 듯이²⁷사이드 분산형 레이저 전압 조정.
   참고: 사용 하 여 라이브 셀 게이팅 세포 파편, 죽은 세포, 또는 집계 제외 하.
10. FL-1 (녹색) 및 플로리다-2 (레드) 채널을 정렬 하 여 % 긍정적인 녹색 DPSCs 및 빨간 PC-3 셀 결정 10000 이벤트 (100000 바람직합니다) 수집.

결과

그림 1 문화 조건 하에서 DPSCs의 일반적인 MSC 특성 묘사. DPSCs (그림 1B) 도금 후 구와 같은 세포 형태학을 발휘 한다. MSC 표면 항 원 (CD29, CD73, CD90, CD105, 및 CD166)은 매우 조 혈 마커 (CD34, CD45, 및 CD14) 동안 표시는 부정적인 (그림 1C). 형태학 및 분자 수준에서 변경 내용을 관련 osteo-chondro-, 그리고 adipo genic 차별?...

토론

종양 환경 MSCs의 기여는 하이브리드 세포 생성을 통해 세포 융해, 줄기 세포와 암 세포²⁸사이 entosis 또는 cytokine 및 chemokine 활동을 포함 한 여러 가지 상호 작용에 의해 통제 된다. 구조 조직, 세포 세포 상호 작용 및 분 비 종양 승진, 진행, 및 주위 조직 전이 암 셀 동작을 결정 합니다. 적절 한 비보 전 모델 시스템 상주 세포 인구의 상호 작용의 뒤에 기계 장치를 조사...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	11885084	For cell culture
FBS	Invitrogen	16000044	For cell culture
PSA	Lonza	17-745E	For cell culture
Trypsin	Invitrogen	25200056	For cell dissociation
PBS	Invitrogen	10010023	For washes
Dexamethasone	Sigma	D4902	Component of differentiation media
β-Glycerophosphate	Sigma	G9422	Component of osteogenic differentiation medium
Ascorbic acid	Sigma	A4544	Component of osteo- and chondro-genic differentiation medium
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS −G)	Invitrogen	41400045	Component of chondrogenic differentiation medium
TGF-β	Sigma	SRP3171	Component of chondrogenic differentiation medium
Insulin	Sigma	I6634	Component of adipogenic differentiation medium
Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)	Sigma	I7018	Component of adipogenic differentiation medium
Indomethacin	Sigma	I7378	Component of adipogenic differentiation medium
MTS Reagent	Promega	G3582	Cell viability analyses
TUNEL Assay	Sigma	11684795910	Apoptotic analyses
24-well plate inserts	Corning	3396	For trans-well migration assay
PKH67	Sigma	PKH67GL	For co-culture cell staining
PKH26	Sigma	PKH26GL	For co-culture cell staining
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	For cell fixation
von Kossa Kit	BioOptica	04-170801.A	For cell staining (differentiation)
Alcian blue	Sigma	A2899	For cell staining (differentiation)