Isolamento di cellule staminali mesenchimali da tessuto della polpa e co-coltura con cellule tumorali per studiare le loro interazioni

Riepilogo

Forniamo i protocolli per la valutazione delle cellule staminali mesenchimali isolate da polpa dentale e interazioni delle cellule di carcinoma della prostata basati su metodi diretti e indiretti di co-coltura. Mezzo di condizione e trans-pozzo membrane sono adatte per analizzare attività paracrina indiretta. Seeding differenzialmente macchiato le cellule insieme è un modello appropriato per interazione diretto cellula-cellula.

Abstract

Il cancro come un processo multistep e malattia complicata è non solo regolato da crescita e proliferazione delle cellule individuali ma anche controllato da interazioni cellula-cellula e ambiente del tumore. Identificazione del cancro e cellule staminali interazioni, compresi i cambiamenti nell'ambiente extracellulare, interazioni fisiche e fattori secreti, potrebbe consentire la scoperta di nuove opzioni di terapia. Uniamo le tecniche di co-cultura conosciuta per creare un sistema modello per cancro e cellule staminali mesenchimali (MSCs) interazioni cellula. Nello studio corrente, le cellule staminali della polpa dentale (DPSCs) e interazioni cellula di PC-3 del carcinoma della prostata sono stati esaminati mediante tecniche dirette e indirette di co-coltura. Medio di condizione (CM) ottenuti da DPSCs e 0,4 µm poro dimensioni trans-pozzo membrane sono state usate per studiare l'attività paracrina. Co-coltura di diversi tipi di cellule insieme è stata effettuata per studiare l'interazione diretto cellula-cellula. I risultati hanno rivelato che CM aumentata proliferazione delle cellule ed in diminuzione di apoptosi nelle colture cellulari del carcinoma della prostata. Sia CM e trans-pozzo sistema aumentata capacità di migrazione delle cellule delle cellule PC-3. Le cellule colorate con membrana diversi coloranti erano teste di serie le stesse navi di cultura, e DPSCs ha partecipato a una struttura auto-organizzata con cellule PC-3 in questa condizione di co-coltura diretta. Nel complesso, i risultati hanno indicato che le tecniche di co-coltura potrebbero essere utile per cancro e interazioni di MSC come sistema modello.

Introduzione

Cellule staminali mesenchimali (MSCs), con la capacità di differenziazione e contributo alla rigenerazione dei tessuti mesenchimali quali l'osso, cartilagine, muscolo, legamento, tendine e adiposo, sono state isolate da quasi tutti i tessuti nel corpo adulto^{1 , 2}. diversi dalla fornitura dell'omeostasi tissutale producendo cellule residenti in caso di infiammazione cronica o una ferita, che producono vitale citochine e fattori di crescita per orchestrare l'angiogenesi, sistema immunitario ed il tessuto che ritocca³. L'interazione di MSCs con tessuto del cancro non è ben compreso, ma raccogliendo la prova suggerisce che MSCs potrebbe promuovere di iniziazione, la progressione e la metastasi del tumore⁴.

La capacità di homing delle MSC nell'area lesa o cronicamente inflamed li rende un valido candidato per terapie basate sulle cellule staminali. Tuttavia, nei tessuti tumorali, "mai guarigione delle ferite", anche rilascio di citochine infiammatorie, molecole pro-angiogenici e fattori di crescita vitale, che attraggono MSCs al cancerogene zona⁵. Mentre ci sono limitati rapporti che mostrano gli effetti inibitori di MSCs su cancro crescita^6,7, loro progressione tumorale e metastasi promuovere effetti sono stati ampiamente riportati⁸. MSCs direttamente o indirettamente influenzare la carcinogenesi in modi diversi, inclusa l'eliminazione di cellule immunitarie, che secernono le citochine/fattori di crescita che supportano la proliferazione della cellula tumorale e migrazione, migliorando l'attività angiogenica e regolazione transizione epiteliale-mesenchimale (EMT)^9,10. Ambiente tumorale è costituito da diversi tipi cellulari fibroblasti cancro-collegati (CAFs) e/o miofibroblasti, cellule endoteliali, adipociti e cellule immuni¹¹. Di quelli, CAFs sono il tipo più abbondante di cellule nella zona del tumore che secernono diverse chemochine, promuovere la crescita e la metastasi di cancro⁸. È stato dimostrato che MSCs derivate da midollo osseo possono differenziare in CAFs nel tumore dello stroma¹².

Cellule staminali della polpa dentale (DPSCs), caratterizzate come il primo MSCs dentale di tessuto-derivato da Gronthos et al. ¹³ nel 2000 e quindi ampiamente studiato da altri^14,15, esprimono marcatori di pluripotenza come Oct4, Sox2, Nanoge¹⁶ e possono differenziarsi in varie cellule linages¹⁷. Analisi di espressione genica e proteica ha dimostrato che DPSCs produrre livelli comparabili di fattori di crescita/citochine con altri MSCs come fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF), angiogenina, fattore di crescita del fibroblasto 2 (FGF2), interleuchina-4 (IL-4), IL-6, IL-10, e fattore di cellula formativa (SCF), così come ligando di chinasi-3 fms-come tirosina (Flt - 3L) che potrebbe promuovere l'angiogenesi, modulano le cellule immuni e sostenere il cancro delle cellule di proliferazione e migrazione^18,19,20 . Mentre le interazioni di MSCs con ambiente di cancro sono state ben documentate nella letteratura, il rapporto tra DPSCs e le cellule tumorali non è stato valutato ancora. Nello studio presente, abbiamo stabilito le strategie di trattamento medio di co-cultura e condizione per una linea cellulare altamente metastatica del carcinoma della prostata, PC-3 e DPSCs a proporre azione potenziale del meccanismo di MSCs dentale nella progressione del cancro e metastasi.

Protocollo

Consenso informato dei pazienti è stata ottenuta dopo l'approvazione del Comitato di etica istituzionale.

1. DPSC isolamento e coltura

1. Trasferire i denti del giudizio ottenuti da giovani adulti di età compresa tra 17 e 20 a 15 mL tubi contenenti per volta Eagle Medium (DMEM di Dulbecco completa) [bassa media DMEM glucosio, completato con 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% di penicillina/streptomicina / amfotericina (PSA) soluzione], entro 8 h dopo resezione. Mantenere il tessuto materiale freddo (4 ° C) durante il trasferimento per evitare la potenziale delle cellule morte.
2. Rimuovere attentamente il tessuto della polpa di pinze dentate sterile dal centro del dente, posizionare il tessuto della polpa a freddo medio DMEM completo in piastre di coltura del tessuto di 10cm e tritateli in piccoli pezzi (2-3 mm) di bisturi.
   Nota: Tutte le procedure sperimentali devono essere effettuate in condizioni di sterilità in cappa a flusso laminare. Questa tecnica non-enzimatica è stato utilizzato in precedenza^21,22,23.
3. Tessuti di polpa piccolo posto all'interno della cultura del tessuto trattato piastre da 6 pozzetti e aggiungere 200 µ l di multimediale DMEM completo per coprire ogni pezzi di tessuto di piccola polpa.
4. Incubare i pozzetti di coltura del tessuto a 37 ° C in un'atmosfera di aria umidificata (80% di umidità) con 5% CO₂ per 2 h fornire il collegamento del tessuto.
   Nota: Questo passaggio potrebbe essere prolungato a 3-4 h controllando l'evaporazione dei media.
5. Aggiungere volume appropriato (2-2,5 mL) di terreno DMEM completo ai pozzetti e incubare a 37 ° C in un'atmosfera di aria umidificata con 5% CO₂ per celle a diffondersi dal tessuto.
   Nota: Le cellule diventano visibili dopo circa 4 giorni e raggiungono la confluenza dopo 8-9 giorni.
6. Quando le cellule raggiungono 80% confluency, rimuovere supporti da piastre da 6 pozzetti, lavare con 2 mL di tampone fosfato salino (PBS) e aggiungere 2 mL di tripsina. Incubare per 2 min in un incubatore a 37 ° C con atmosfera di aria umidificata e 5% CO₂. Quindi aggiungere 2 mL di terreno DMEM completo seguito da incubazione 2 min per inibire la tripsina. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 min agglomerare le cellule.
7. Cellule di passaggio per le beute in completa DMEM media e archivio per ulteriori esperimenti. Aggiungere 15 mL di multimediale completo di DMEM al boccette di T-75 e cellule di trasferimento da due pozzetti della piastra 6 pozzetti per boccette di T-75 uno e incubare a 37 ° C con aria umidificata atmosfera e 5% CO₂.

2. caratterizzazione di DPSCs

1. Eseguire analisi morfologiche.
   1. Cellule di seme (passo 1.6) nella coltura del tessuto rivestito boccette (o piastre da 6 pozzetti) in terreno DMEM completo per almeno 8 passaggi osservare la morfologia delle cellule.
   2. Visualizzare le cellule dal microscopio ottico e definire la morfologia delle cellule del fibroblasto-come. Le cellule dovrebbero allegare per i piatti di cultura e morfologia delle cellule dell'alberino-come.
      Nota: In alternativa, le cellule possono essere coltivate come singole cellule fino a 14 giorni in piastre a pozzetti per osservare la capacità di formazione di Colonia che è una caratteristica specifica dei fibroblasti e MSCs.
2. Eseguire analisi di superficie dell'indicatore.
   1. Tripsinizzano le cellule dal punto 1.7. Rimuovere il supporto dal pallone di coltura del tessuto T-75, lavare con 2 mL di PBS e aggiungere 2 mL di tripsina. Incubare per 2 min in un incubatore a 37 ° C con atmosfera di aria umidificata e 5% CO₂. Quindi aggiungere 2 mL di terreno DMEM completo seguito da incubazione 2 min per inibire la tripsina. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 min agglomerare le cellule.
   2. Fissare le cellule con paraformaldeide al 4% per 20 min a temperatura ambiente in provette da 1,5 mL e poi lavarli con 500 µ l di PBS 3 volte per rimuovere paraformaldeide.
   3. Incubare le cellule fisse con gli anticorpi contro CD29, CD34, CD14, CD45, CD90, CD105, CD166 e CD73 per 1 h a 4 ° C in 100 µ l di PBS.
      Nota: La concentrazione di anticorpo utilizzato è 0,5 µ g/mL. CD45, CD14 e CD34 sono usati come indicatori negativi, mentre CD29, CD90, CD105, CD166 e CD73 sono usati come indicatori della superficie delle cellule positive per MSCs.
   4. Lavare le cellule 3 volte con PBS e utilizzare i rispettivi anticorpi secondari quali isotiocianato di fluorescina (FITC), ficoeritrina (PE), ecc per l'etichettatura. Incubare le cellule con anticorpi secondari 1: 500 diluito in 100 µ l di PBS per 30 min a 4 ° C e lavare 3 volte con PBS.
   5. Mantenere i campioni al buio per l'analisi di citometria a flusso e rilevare positivi e negativi di colorazione tramite flusso cytometry.
      Nota: Utilizzare le cellule di controllo non macchiate per disporre dispersione avanti e laterali. Organizzare il gating di positivamente macchiato popolazioni escludendo le cellule morte, detriti e popolazione non-macchiata. Utilizzare 100 µm ugello con 45 psi di pressione di guaina e raccogliere 10.000 eventi per determinare DPSCs positivo organizzando canali.
3. Eseguire la differenziazione di DPSCs.
   1. Cellule di⁴ seme 1 × 10 sulle piastre a 24 pozzetti in completano media DMEM e incubare per 24 h a 37 ° C in un'atmosfera di aria umidificata con 5% CO₂.
   2. Formulare la differenziazione media utilizzando competere medium DMEM come supporto di base. Preparare i supporti osteogenici mescolando 100 nM desametasone, β-glicerofosfato di 10 mM e acido ascorbico 0.2 mM. Preparare i supporti condrogenica mescolando 1 × insulina-transferrina-selenio (ITS-G), 100 nM desametasone, 100 ng/mL crescita fattore trasformante beta (TGF-β), 14 μg/mL di acido ascorbico e 1 mg/mL albumina di siero bovino (BSA). Preparare i supporti adipogenico mescolando 100 nM desametasone, insulina di 5 μg/mL, 0,5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) e indometacina di 60 μM.
      Nota: Media di differenziazione può essere mantenuto a 4 ° C per almeno una settimana.
   3. Cambiare la crescita media a osteo-, condro- o differenziazione adipo-genica supporto e aggiornamento media due volte a settimana per due settimane.
   4. Confermare la differenziazione di von Kossa e Alcian blu colorazione, attività enzimatica (attività della fosfatasi alcalina), immunocitochimica e analisi (qPCR) reazione a catena della polimerasi quantitativa secondo i protocolli precedentemente descritto²¹.
      1. Eseguire colorazioni di Alcian blu e von Kossa sulle cellule che sono fissate con paraformaldeide al 4% a temperatura ambiente per 10 min. lavare le cellule fisse con PBS e li macchia con il kit di vonKossa secondo le raccomandazioni del produttore per osservare i giacimenti del calcio .
      2. Preparare la soluzione di colorazione sciogliendo 1,00 g di colorante blu di Alcian in 100 mL di acido acetico al 3% (v/v) per ulteriore colorazione blu di Alcian. Lavare le cellule fisse con PBS e macchia le cellule per 30 min con soluzione di Alcian blu. Visualizzare i campioni macchiati da un microscopio ottico.

3. preparazione della condizione medio (CM)

1. Sostituire il supporto delle cellule dal passaggio 1.7 con fresca completa DMEM 24 h prima collezione CM.
   Nota: Passaggio 2-4 è consigliato.
2. Raccogliere media condizione (CM) da DPSCs colta quando le cellule di raggiungere confluency di 80%. Centrifugare media raccolti a 300 x g per 5 min rimuovere rifiuti tessuto materiale e detriti cellulari.
   Nota: In alternativa, utilizzare filtri per siringa 0,2 µm per rimuovere i detriti dal mezzo di condizione.
3. Raccogliere il surnatante e conservare a-20 ° C per ulteriori esperimenti.
   Nota: Conservare il supernatante a-80 ° C per la conservazione a lungo termine.

4. trattamento delle cellule tumorali con CM

1. Eseguire analisi di attuabilità delle cellule.
   1. Cellule PC-3 semi (cellule di carcinoma della prostata umane) in piastre da 96 pozzetti ad una densità di cella di 5 × 10³ cellule/pozzetto in DMEM di completare e incubare in una camera umidificata a 37 ° C e 5% di CO₂ per 24 h.
   2. Curare le cellule con 10, 20, 30, 40 e 50% cm (v/v) mescolate con DMEM completo per 24 h.
   3. Misurare la vitalità cellulare tramite 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxy-phenyl)-2-(4-sulfo-phenyl)-2H-tetrazolium (MTS)-dosaggio come descritto in precedenza²⁴.
2. Eseguire terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick fine etichettatura analisi (TUNEL).
   1. Cellule PC-3 seme su coltura cellulare 6 pozzetti piastre ad una densità di cella di 2 × 10⁵ cellule/pozzetto e incubare per una notte in una camera umidificata a 37 ° C e 5% CO₂ .
   2. Mescolare 20% (v/v) di CM con completare mezzo DMEM e applicare alle celle per 24 h.
   3. Tripsinizzano cellule e sospendere in 50 μL di miscela di reazione di TUNEL (etichettatura soluzione + soluzione enzimatica, fornito nel kit) e incubare a 37 ° C per 60 min in un'atmosfera di₂ umidificata e 5% di CO.
      Nota: Per trypsinization, rimuovere i supporti da piastre per colture cellulari a 6 pozzetti, lavare con 1 mL di PBS e aggiungere 500 µ l di tripsina. Incubare per 2 min in un incubatore a 37 ° C con atmosfera di aria umidificata e 5% CO₂. Aggiungere 1 mL di terreno DMEM completo seguito da incubazione 2 min per inibire la tripsina. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 min agglomerare le cellule.
   4. Risciacquare con PBS e analizzare le cellule in PBS tramite flusso cytometry.
3. Eseguire analisi qPCR.
   1. Cellule PC-3 seme su coltura cellulare 6 pozzetti piastre ad una densità di cella di 2 × 10⁵ cellule/pozzetto e incubare per una notte in un incubatore a 37 ° C e 5% CO₂ .
   2. Mescolare 20% (v/v) di CM con completare mezzo DMEM e applicare alle celle per 24 h.
   3. Tripsinizzano cellule e raccogliere il pellet cellulare per la sintesi di RNA isolamento e cDNA.
      Nota: Rimuovere i supporti da piastre per colture cellulari a 6 pozzetti, lavare con 1 mL di PBS e aggiungere 500 µ l di tripsina. Incubare 2 min in un incubatore a 37 ° C con atmosfera di aria umidificata e 5% CO₂. Aggiungere 1 mL di terreno DMEM completo seguito da incubazione 2 min per inibire la tripsina. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 min agglomerare le cellule.
   4. Esperimenti di qPCR secondo il protocollo descritto in precedenza²⁵.
4. Eseguire la migrazione delle cellule delle cellule tumorali.
   1. Seme 1 × 10⁵ PC-3 cellule sul 12-pozzetti e incubare in un incubatore umidificato durante la notte a 37 ° C e 5% CO₂.
   2. Graffiare le cellule con una punta sterile 200 μL e sostituire il terreno immediatamente con medium fresco contenenti varie concentrazioni di CM [ad es., 10, 20, 30, 40 e 50% cm (v/v) mescolato con DMEM completo].
   3. Osservare graffi sotto un microscopio invertito e scattare foto a intervalli di tempo diversi (0 e 24 h).
   4. Misurare la chiusura gratta e Vinci utilizzando il software Image J utilizzando la formula:
      
      Nota: Aprire l'immagine gratta e Vinci con software Image J. Disegnare una linea che ha la stessa grandezza come la barra della scala che esiste già nell'immagine. Fare clic su analizza, impostare scala e osservare la distanza in pixel come l'ingrandimento della linea disegnata. Scrivere la dimensione della barra della scala alla parte di distanza nota, organizzare unità (pixel, centimetri, ecc.) e fare clic su ok. Vai alla sezione analizza nuovamente e clicca su misure. In primo luogo, questo vi darà la dimensione della barra della scala come unità di misura selezionata. Fare clic su un bordo di gratta e Vinci e trascinare fino a raggiungere l'altra estremità del graffio. Prendere nota del valore di ciascun punto di tempo (0 h e 24 h). Inserire questi valori nella formula sopra riportata e calcolare la chiusura gratta e Vinci.

5. cell migrazione per contatto indiretto delle cellule tumorali e DPSCs

1. Seme 3 × 10⁴ DPSCs sulla piastra a 24 pozzetti inserti con 0,4 μm del poro e incubare in un incubatore durante la notte a 37 ° C.
2. Le cellule PC-3 di semi sui 24 pozzetti piastre a una densità di cella di 5 × 10⁴ e incubare in un incubatore umidificato durante la notte a 37 ° C e 5% CO₂.
3. Graffiare le cellule PC-3 con una punta sterile 200 μL, sostituire il terreno con mezzo fresco e posizionare inserti portato DPSCs sulla cellule PC-3.
4. Osservare le cellule al microscopio invertito e scattare foto a intervalli di tempo diversi (0 e 24 h) per analizzare la migrazione cellulare.

6. analisi di co-cultura e analisi di citometria a flusso

1. Etichetta le cellule PC-3 e DPSCs utilizzando PKH67 (verde) e PKH26 (rosso) delle cellule fluorescenti del linker coloranti, rispettivamente²⁶.
2. Tripsinizzano cellule PC-3 e DPSCs, rispettivamente. Rimuovere il supporto dal pallone di coltura del tessuto T-75, lavare con 2 mL di PBS e aggiungere 2 mL di tripsina. Incubare per 2 min in un incubatore a 37 ° C con atmosfera di aria umidificata e 5% CO₂. Aggiungere 2 mL di terreno DMEM completo seguito da incubazione 2 min per inibire la tripsina.
3. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 min, eliminare il surnatante e risospendere il pellet cellulare nella soluzione colorante preparata in tampone diluente-C fornito dal kit (Vedi Tabella materiali).
4. Incubare le cellule nella soluzione colorante per 10 min e terminare la reazione di macchiatura aggiungendo 100 µ l di FBS. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 min, scartare il surnatante e lavare le cellule con il mezzo di crescita completa prima di co-coltura.
5. Piastra con l'etichetta cellule (5 × 104/bene) su piastre da 6 pozzetti con rapporto 1:1 (DPSCs: PC3). Mantenere le cellule co-coltivate in DMEM completo.
6. Raccogliere le cellule dopo periodi di incubazione di 24 o 48 ore mediante centrifugazione delle cellule a 300 x g per 5 min ed il lavaggio con PBS.
7. Risospendere le cellule in 300 µ l di fluorescenza-attivato delle cellule ordinamento buffer (FACS) in 5 mL basso flusso cytometry tubi rotondi. Vortex per disperdere aggregati cellulari in prima analisi del campione.
8. Utilizzare un ugello di 100 µm con 45 psi di pressione di guaina.
   Nota: Estremamente alta portata potrebbe diminuire la sensibilità di rilevazione di fluorescenza.
9. Utilizzare le cellule di controllo non macchiate e singole celle colorate per regolare appropriato avanti e tensione di laser a dispersione laterale per tipi cellulari e compensazione come accennato in precedenza il²⁷.
   Nota: Utilizzare gating per cellule vive per escludere detriti cellulari, cellule morte o aggregati.
10. Raccogliere 10.000 eventi (100.000 è preferibile) per determinare la percentuale positiva DPSCs verde e rosse cellule PC-3 organizzando FL-1 (verde) e canali di FL-2 (rosso).

Risultati

Figura 1 illustra le caratteristiche generali di MSC di DPSCs in condizioni di coltura. DPSCs esercitare morfologia fibroblasto-come delle cellule dopo il placcaggio (Figura 1B). Antigeni di superficie MSC (CD29, CD73, CD90, CD105 e CD166) sono altamente espressi mentre marcatori ematopoietici (CD34, CD45 e CD14) sono negativi (Figura 1). Modifiche a livello morfologico e molecolare relativo a osteo-...

Discussione

Contributo di MSCs per ambiente tumorale è regolata da numerose interazioni tra cui ibrido cellulare generazione tramite cella fusioni, Citoplasto o citochine e chemochine attività tra cellule staminali e cancro cellule²⁸. Organizzazione strutturale, interazioni cellula-cellula e fattori secreti determinano il comportamento delle cellule di cancro in termini di promozione del tumore, la progressione e la metastasi al tessuto circostante. Corretto ex vivo sistemi modello per stu...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	11885084	For cell culture
FBS	Invitrogen	16000044	For cell culture
PSA	Lonza	17-745E	For cell culture
Trypsin	Invitrogen	25200056	For cell dissociation
PBS	Invitrogen	10010023	For washes
Dexamethasone	Sigma	D4902	Component of differentiation media
β-Glycerophosphate	Sigma	G9422	Component of osteogenic differentiation medium
Ascorbic acid	Sigma	A4544	Component of osteo- and chondro-genic differentiation medium
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS −G)	Invitrogen	41400045	Component of chondrogenic differentiation medium
TGF-β	Sigma	SRP3171	Component of chondrogenic differentiation medium
Insulin	Sigma	I6634	Component of adipogenic differentiation medium
Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)	Sigma	I7018	Component of adipogenic differentiation medium
Indomethacin	Sigma	I7378	Component of adipogenic differentiation medium
MTS Reagent	Promega	G3582	Cell viability analyses
TUNEL Assay	Sigma	11684795910	Apoptotic analyses
24-well plate inserts	Corning	3396	For trans-well migration assay
PKH67	Sigma	PKH67GL	For co-culture cell staining
PKH26	Sigma	PKH26GL	For co-culture cell staining
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	For cell fixation
von Kossa Kit	BioOptica	04-170801.A	For cell staining (differentiation)
Alcian blue	Sigma	A2899	For cell staining (differentiation)