ラット胎盤ナチュラルキラー細胞細胞溶解機能の評価のためのプレートベースの細胞毒性アッセイ

要約

ここでは、比色プレートアッセイによって胎盤からナチュラルキラー細胞の細胞毒性機能を分離・評価するための詳細な方法論を提供する。胎盤虚血の減少した子宮灌流圧ラットモデルは、抗体媒介性の分離とナチュラルキラー細胞の細胞傷害機能の評価を実証するために選ばれた。

要約

Decidual ナチュラルキラー (NK) 細胞が正常妊娠の確立と維持に重要な役割を果たすことはよく知られています。最近の研究は、再発流産や子癇前症などの有害な妊娠合併症に苦しむ女性で、循環し、decidual NK 細胞の変化した人口を示しました。我々のグループからの研究では、妊娠中の高血圧は、表面活性化マーカーの発現に基づいて、胎盤の活性化された NK 細胞の増加した集団と関連していることが示されている。本稿では、外科的に誘導された胎盤虚血の子癇前症様動物モデルに胎盤から分離した NK 細胞の細胞毒性機能を評価するための詳細なプロトコールを提供する。以下のステップについて詳細に説明する: 単一細胞懸濁液の生成、NK 細胞単離、ex in vivo 刺激、エフェクター: 標的細胞共培養、および細胞傷害アッセイ。

概要

子癇前症は、胎児の発育制限、末端器官の損傷および慢性免疫活性化によって特徴付けられる妊娠の高血圧性障害である。子癇前症の女性における慢性免疫活性化は、増加した循環および胎盤炎症性サイトカイン、CD4⁺ T 細胞集団の不均衡、および活性化されたナチュラルキラー (NK) 細胞の集団の増加につながる。当研究室が最近発表した研究は、子癇前症の減少した子宮灌流圧 (ラップ) ラットモデルにおける子癇前症に関連する病態生理学の一部を引き起こすことにおける NK 細胞の役割を実証する。フローサイトメトリーを用いて、NK 細胞に対する活性化マーカーの表面発現を測定するために、正常な妊娠 (NP) ラットと比較してラップラットの循環および胎盤における活性化 NK 細胞の集団の増加が観察された²。

フローサイトメトリー観測を確認するために、NP およびラップラットの胎盤から単離された NK 細胞の細胞傷害活性を評価するための機能的研究を行った。細胞傷害性 CD8⁺ T 細胞および NK 細胞の細胞毒性機能の評価のために利用可能ないくつかの方法がある。機能的細胞傷害性分析のための金本位は、クロム放出アッセイ³である。利用される他の発達したプロトコルは、フローサイトメトリー⁴、イメージサイトメトリ⁵、カルセインリリース⁶、および最も最近の生物発光⁷を含む。このビデオでは、市販の LDH 細胞毒性アッセイキットを使用して NK セルの細胞毒性機能を測定するために、十分に確立された乳酸脱水素酵素 (LDH) 放出アッセイを用いた詳細なプロトコルを提供する。

プロトコル

すべてのプロトコルは、ミシシッピ大学医療センターの機関の動物ケアと使用委員会によって承認されました。動物のケアと取り扱いは、倫理的な動物治療のための健康ガイドラインの国立研究所と一致していました。

1. 胎盤からのリンパ球細胞の分離

1. ラット子宮から1つの胎盤を除去し (妊娠19日目)、10 mL の氷冷 PBS⁸に入れる。
2. 100μ m フィルターに1つの胎盤を置き、13.5 mL の RPMI および 1.5 mL の FBS を含むペトリ皿に座らせる (総容積は 15 mL である)。注射器の平らな面を使用してフィルターを通して胎盤をペトリ皿に押し込む。
3. 各組織に 3 15 mL の円錐チューブを準備します。各チューブに密度勾配培地 (材料の表を参照) を 3 ml 追加し、均質化した胎盤5ml を各チューブに慎重にオーバーレイします。
4. 300 x gで室温 (RT) で25分間遠心分離し、ブレーキをかけない。転写ピペットで薄い白のバフィー層を収集します。
   注:遠心分離後、3層が表示され、上部には赤色の RPMI、中央には白色の軟部層、下部には透明な密度の勾配媒体層があります。トランスファーピペットを使用して、チューブから白いバフィー層を引き上げます。同じ胎盤のすべてのチューブからのバフィー層を1つのチューブに結合します。
5. 結合されたバフィー層に 10 mL の RPMI を加えます。10分、300 x g、4° c で遠心分離を行い、上清を廃棄します。

2. ナチュラルキラー細胞の分離

1. 50μ l の氷冷 PBS 中の再懸濁細胞ペレット
2. メーカーのプロトコルに従ってペレット化された細胞にビオチン標識 CD3 抗体を追加し、ピペットでよく混ぜる.チューブ回転子にチューブを置き、4° c で20分インキュベートします。
3. 1 mL の RPMI を加え、400 x gおよび4° c で10分間遠心分離し、そして上澄みを捨てる。
4. 再懸濁ペレットを 1 mL の RPMI で、1.5 mL マイクロ遠心チューブ中の150μ l の磁気ビーズと組み合わせます。チューブ回転子にマイクロ遠心チューブを置き、4° c で30分間インキュベートしながら回転させます。
   注:この時点でリリースバッファを引き出して、バイオセーフティキャビネットの RT に到達することができます。
5. 1分間の磁石にチューブを配置し、上清を収集し、氷の上に 15 mL のチューブ内の CD3 細胞集団を保存します。
   注:これは CD3^-細胞の集団です。
6. マグネットからチューブを取り出し、1 mL の RPMI を加えます。ピペットで細胞とビーズを5回混合する。
7. ステップ2.5 を繰り返します。
8. 400 x gおよび4° c で10分間細胞の CD3^-集団を遠心分離し、上清を捨てる。細胞ペレットを50μ l の氷冷 PBS で再懸濁
9. メーカーのプロトコルに従って CD3 細胞にビオチン標識された CD161a 抗体を追加し、よく混ぜる.チューブ回転子にチューブを置き、4° c で20分間インキュベートします。
10. 1 mL の RPMI を加え、400 x gおよび4° c で10分間遠心分離し、そして上澄みを捨てる。再懸濁ペレットを 1 mL の RPMI で、1.5 mL マイクロ遠心チューブ中の150μ l の磁気ビーズと組み合わせます。
11. チューブ回転子にマイクロ遠心チューブを配置し、4° c で30分間インキュベートしながら回転させます。
12. 1分間磁石にチューブを置き、上清を収集し、CD3^-/CD161a 細胞を捨てます。
13. マグネットからチューブを取り出し、1 mL の RPMI を加えます。ピペットで細胞とビーズを5回混合する。
14. ステップ2.12 を繰り返します。
15. マグネットからマイクロ遠心チューブを取り外し、1 mL の RT リリースバッファを追加します。管の回転子に管を置き、RT の 15 min のためにインキュベートしている間回転しなさい。
16. 1分間磁石にチューブを置き、氷の上に新しい 15 mL の円錐管で上清を収集します。
    注:これが NK 細胞の個体数です。
17. マグネットからチューブを取り出し、RT RPMI 1 mL を加えます。ピペットで細胞とビーズを5回混合します。
18. ステップ2.16 を繰り返し、同じチューブに上清を置く。よく混ぜると細胞を数える20μ l のサンプルを取る
    注:チューブを氷上に保つ。
19. /CD161a +細胞を 10 分間、400 x gを4° c で遠心分離し、その後、上清を除去する。再懸濁の細胞を RPMI (10% FBS、1% ペン/喉頭炎、2 ng/mL IL-2) および 3 x 10⁵細胞/ウェルの 2.5 ML の NK 細胞活性化培地中で播種する。48 h の細胞を37° c でインキュベートし、 5% co2 を加湿したインキュベーター内で培養する。

3. 細胞毒性アッセイ: 培養または通過細胞から NK 細胞または YAC1 を取り出す

注:すべてのステップは、ボンネットの下で行わなければなりません。すべての細胞管は常に氷上で維持されなければならない。

1. ガラス血清 pipet を使用して、フラスコから YAC1 細胞および培地を収集し、氷上で 50 mL チューブに置き、よく混ぜる。細胞を数える20μ l を取る。
2. YAC1 細胞を 300 x gおよび4° c で10分間スピンさせる。これらがスピンしている間、セルを数えます。
3. NK 細胞6ウェルプレートの各ウェルにトリプシン/EDTA を加えます。プレートをタップし、インキュベーター内に配置します。
4. 細胞をトリプシン/EDTA と共に37° c で ~ 5 分間インキュベートした後、プレート/フラスコを滅菌プレートスクレーパーで掻き取る。各ウェルに 1 mL の NK 細胞培地を加えます。
5. 血清学的 pipet を用いて細胞および培地を収集し、15 mL の遠心管に集めます。細胞を数える20μ l を取る。
6. NK 細胞を10分間、400 x gを4° c で回転させる。この遠心分離の間にステップ3.5 からの細胞のサンプルを数える。
   注:培養プレートを廃棄する前に顕微鏡で見て、井戸の底に付着した細胞がないことを確認します。この実験では NK 細胞と YAC1 細胞を使用しているため、それぞれを個別にカウントしてください。
7. 最適化試験で決定された濃度で細胞および再懸濁をカウントし、適切な数の標的: エフェクター比を試験する。これは、次の細胞濃度を作るために、対応する媒体中のペレットを再懸濁させることによって達成される: 4 x 10⁵細胞/ML で YAC1、NK 細胞を 2 x 10⁷細胞/ml で。

4. 細胞毒性アッセイ: アッセイプロトコル

1. 円形ボトムを使用して、培養処理 96-ウェルプレートは、表 1に示唆されるようにプレートをセットアップする。次の表は、実験的なコントロールと3セットの NK 実験カラムを示しています。これは96プレートの NK 実験カラムを合計10個まで拡大することができます。
2. 250 x gのアッセイプレートを4分間遠心し、エフェクタとターゲットセルが接触していることを確認します。96-ウェルプレートを37° c で加湿されたチャンバーインキュベーター内で5時間インキュベートし、5% co2 をエフェクター細胞による標的細胞およびエフェクターセルと標的細胞溶解との十分な接触を達成する。
   注:プロトコルはここで一時停止することができます。
3. 45分上清を収穫する前に、ターゲット細胞最大 LDH 放出ウェル (ウェル1E、1F、1G、1H) に10μ l を添加し、プレートを加湿チャンバ内に戻します。
4. インキュベーション時間が終了したら、250 x gのプレートをマルチチャンネル Pipettor を使用して4分間遠心し、すべてのウェルから50μ l のアリコートを新鮮な96ウェルフラットボトムアッセイプレートに移します。
   注:細胞が新鮮なアッセイプレートに移されないように、ウェルの底部に触れないでください。培養処理したプレートをフレッシュなアッセイプレートとして使用しないでください。
5. アッセイ試薬を作成します。
   1. アッセイバッファーが室温に達した後、12 mL のアッセイバッファーを1つの基板混合ボトルに追加します。反転し、完全に溶解するまで穏やかに振る。1ボトルは 2 96 ウェルプレートのために十分です。
      注:アッセイバッファーは、解凍中に光から保護する必要があります。使用直前に混ぜます。
6. ステップ4.6 からのアッセイプレートのすべてのウェルに50μ l のアッセイ試薬を加えます。光から保護するためにホイルでプレートを覆い、室温で30分インキュベートします。
   注:新しく作られた試金試薬はフリーザーで貯えられるべきである。試薬は約8週間有効です。
7. 各井戸に50μ l の停止溶液を加えます。停止溶液を加えた後、1時間以内にプレートを読み取り、490 nm で吸光度を記録します。代表的なデータを表 2に示す。

5. 結果の計算

1. 培養基のバックグラウンドウェルからの平均吸光度値を計算し、実験のためのすべての吸光度値から差し引く、標的細胞自発的 LDH 放出およびエフェクター細胞自発 LDH 放出井戸。
2. ボリューム補正制御ウェルの平均吸光度値を計算し、ターゲットセル最大 LDH 放出制御ウェルについて取得された吸光度値から減算します。
3. 次の式でステップ5.1 と5.2 の修正後の値を使用して、各エフェクタの細胞毒性率を計算します。
   

結果

NP 及びラップラットから得られた胎盤 NK 細胞を50:1 の割合でそれぞれの媒体中の標的細胞と共に5時間インキュベートした (NK: 標的)。吸光度は 490 nm で記録され、生データは表 2に示されている。培地背景と体積補正制御ウェルの平均吸光度を計算した。これらの平均値は、製造元のプロトコルに示されている適切なウェルから減算され、表 3に示します。次いで、修?...

ディスカッション

最適な結果を得られるように考慮すべき重要事項がいくつかあります。利用される細胞の無菌性は非常に重要である。胎盤の採取の後、NK 細胞の調製および単離がバイオセーフティキャビネットの無菌条件下で行われることが重要です。さらに、すべての細胞が細胞損傷によって LDH を放出するので、分離後および共培養プロセス中に NK 細胞の高い生存率を得るために注意が必要である。NK ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Eppendorf tube	Fisher	5408129
100 µL Filter	Fisher	22363549	Nylon Mesh
15 mL conical tube	Fisher	0553859A
3 mL syringe	Fisher	14823436
50 mL conical tube	Fisher	7203510
6-well cell culture plate	Corning	720083
96-well Tissue Culture Plate	CELLTREAT	229190	Sterile, Round Bottom
AOPI	Nexcelom	CS201065ML
Cell scraper	Fisher	8100241
Cellometer Disposable Counting Chambers	Nexcelom	CHT4-SD100
Cellometer Vision Image Cytometer	Nexcelom	N/A
Cytotox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit	Promega	G1780
Dynabeads Flowcomp Flexi Kit	Invitrogen	11061D
DynaMag-2 Magnet	Invitrogen	12321D
EDTA	Sigma Aldrich	EDS-100G
FBS	Atlanta Biologicals	S11150H
Flow Cytometry Tube	Corning	352008
Lymphoprep	Fisher	NC0460539	Density gradient medium; 4 x 250 mL
PBS	Fisher	SH3025801	10 x 500 mL
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140122
Petri dishes	Fisher	9720500	Without Pad
Purified Mouse anti-Rat CD161a	BD Biosciences	555006
Purified Mouse anti-Rat CD3	BD Biosciences	554829
Recombinant Rat IL-2	R&D Systems	502-RL
RPMI	Gibco	11875135	1640 Medium
T25 flask	Corning	430639
Trypsin	ThermoFisher	15090046
YAC-1 cell	ATCC	TIB-160