Un dosage de cytotoxicité à base de plaques pour l’évaluation de la fonction cytolytique des cellules tueuses naturelles du rat placentaire

Résumé

Ici, nous fournissons une méthodologie détaillée pour isoler et évaluer la fonction cytotoxique des cellules tueuses naturelles de placentas par un dosage de la plaque colorimétrique. Le modèle de rat à pression de perfusion utérine réduit de l’ischémie placentaire a été choisi pour démontrer l’isolement et l’évaluation par médiation des anticorps de la fonction cytotoxique des cellules tueuses naturelles.

Résumé

Il est bien connu que les cellules du tueur naturel (NK) déciduelles jouent un rôle crucial dans l’établissement et le maintien d’une grossesse normale. Des études récentes ont montré une population altérée de cellules NK circulantes et décibiales chez les femmes qui souffrent de complications de grossesse défavorables telles que la fausse couche récurrente et la prééclampsie. Des études de notre groupe ont montré que l’hypertension dans la grossesse est associée à une population accrue de cellules NK activées dans le placenta en fonction de l’expression des marqueurs d’activation de surface. Ce manuscrit fournit un protocole détaillé pour évaluer la fonction cytotoxique des cellules NK isolées des placentas dans un modèle animal de type prééclampsie d’ischémie placentaire induite chirurgicalement. Les étapes suivantes sont décrites en détail: génération de suspension à cellule unique, isolement cellulaire NK, stimulation ex vivo, effecteur: co-culture des cellules cibles et dosage de la cytotoxicité.

Introduction

La prééclampsie est un trouble hypertensif de la grossesse caractérisé par la restriction de croissance fœtale, les lésions des organes finaux et l’activation immunitaire chronique. L’activation immunitaire chronique chez les femmes atteintes de prééclampsie conduit à une augmentation de la circulation et des cytokines inflammatoires placentaires, un déséquilibre dans les cellules CD4⁺ T populations, et une population accrue de cellules de tueur naturel (NK) activées¹. Les études récemment publiées par notre laboratoire démontrent un rôle pour les cellules NK en provoquant une partie de la pathophysiologie associée à la prééclampsie dans le modèle de rat de prééclampsie de la pression de perfusion utérine réduite (RUPP). En utilisant la cytométrie en flux pour mesurer l’expression de la surface des marqueurs d’activation sur les cellules NK, on a observé une augmentation de la population des cellules NK activées dans la circulation et les placentas des rats RUPP comparativement aux rats normaux gravides (NP)².

Pour confirmer les observations de cytométrie en flux, des études fonctionnelles pour évaluer l’activité cytotoxique des cellules NK isolées des placentas des rats NP et RUPP ont été effectuées. Il existe plusieurs méthodes disponibles pour l’évaluation de la fonction cytotoxique des cellules cytotoxiques de l⁺ T et des cellules NK. La norme d’or pour l’analyse cytotoxique fonctionnelle est le test de libération du chrome³. D’autres protocoles développés utilisés incluent cytométrie en flux⁴, cytométrie d’image⁵, calcéine Release⁶, et plus récemment bioluminescence⁷. Cette vidéo fournira un protocole détaillé sur l’utilisation du dosage bien établi de la lactate déshydrogénase (LDH) pour mesurer la fonction cytotoxique des cellules NK à l’aide d’un kit de dosage de cytotoxicité LDH disponible dans le commerce.

Protocole

Tous les protocoles ont été approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du centre médical de l’Université du Mississippi. Les soins et la manipulation des animaux étaient conformes aux directives des instituts nationaux de la santé pour le traitement éthique des animaux.

1. isolement des cellules lymphocytes des placentas

1. Retirer un placenta de l’utérus du rat (jour de gestation 19) et le placer dans 10 mL de PBS⁸à froid glacé.
2. Placez un placenta sur un filtre de 100 μM et asseyez-vous dans une boîte de Petri contenant 13,5 mL de RPMI et 1,5 mL de FBS (le volume total est de 15 mL). Utilisez le côté plat d’un piston de seringue pour pousser le placenta dans le filtre dans la boîte de Petri.
3. Préparer 3 15 mL de tubes coniques pour chaque tissu. Ajouter 3 mL de milieu dégradé de densité (voir tableau des matériaux) à chaque tube, puis recouvrir soigneusement 5 ml de placenta homogénéisé dans chaque tube.
4. Centrifuger pendant 25 min à 300 x g à température ambiante (RT) sans frein. Collectez la couche mince de Buffy blanche avec une pipette de transfert.
   Remarque: Après centrifugation, 3 couches sont visibles, le RPMI rouge en haut, la couche de Buffy blanche au milieu, et la couche moyenne de gradient de densité claire en bas. Utilisez une pipette de transfert pour tirer vers le haut la couche de Buffy blanche du tube. Combiner la couche Buffy de tous les tubes du même placenta en 1 tube.
5. Ajouter 10 mL de RPMI aux couches de Buffy combinées. Centrifuger pendant 10 min, 300 x g, à 4 ° c et jeter le surnageant.

2. isolement des cellules tueuses naturelles

1. Resuspendre le culot cellulaire dans 50 μL de PBS glacé
2. Ajouter l’anticorps de l’étiquette de la biotine sur les cellules granulées selon le protocole du fabricant et bien mélanger avec une pipette. Placer le tube dans un rotateur tubulaire et incuber 20 min à 4 ° c.
3. Ajouter 1 mL de RPMI, centrifuger pendant 10 min à 400 x g et 4 ° c, et jeter le surnageant.
4. Resuspendre le culot dans 1 mL de RPMI et le combiner avec 150 μL de billes magnétiques dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL. Placer le tube de microcentrifugation dans un rotateur de tube et faire pivoter tout en incubant pendant 30 min à 4 ° c.
   Remarque: Retirer le tampon de dégagement à ce moment et permettre d’atteindre RT dans l’armoire de biosécurité.
5. Placer les tubes dans l’aimant pendant 1 min. collecter le surnageant et sauver la population de la cellule-4 dans un tube de 15 mL sur la glace.
   Remarque: Il s’agit de la population de cellules.
6. Retirer le tube de l’aimant et ajouter 1 mL de RPMI. Mélanger les cellules et les billes 5 fois avec une pipette.
7. Répétez l’étape 2,5.
8. Centrifuger la population de cellules de 1 à 10 min à 400 x g et 4 ° c et jeter le surnageant. Resuspendre le culot cellulaire dans 50 μL de PBS glacé
9. Ajouter l’anticorps CD161a marqué par la biotine aux cellules de la base du protocole du fabricant et bien mélanger. Placer le tube dans un rotateur tubulaire et incuber pendant 20 min à 4 ° c.
10. Ajouter 1 mL de RPMI, centrifuger pendant 10 min à 400 x g et 4 ° c, et jeter le surnageant. Resuspendre le culot dans 1 mL de RPMI et le combiner avec 150 μL de billes magnétiques dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL.
11. Placer le tube de microcentrifugation dans un rotateur de tube et faire pivoter tout en incubant pendant 30 min à 4 ° c.
12. Placer les tubes dans un aimant pendant 1 min. collecter le surnageant et jeter les cellules de la CD ^-/cd161a.
13. Retirer le tube de l’aimant et ajouter 1 mL de RPMI. Mélanger les cellules et les billes 5 fois avec une pipette.
14. Répétez l’étape 2,12.
15. Retirer les tubes de microcentrifugation de l’aimant et ajouter 1 mL de tampon de dégagement RT. Placer le tube sur le rotateur de tube et faire pivoter tout en incubant pendant 15 min à RT.
16. Placer les tubes dans l’aimant pendant 1 min. recueillir le surnageant dans un nouveau tube conique de 15 mL sur la glace.
    Remarque: Il s’agit de la population des cellules NK.
17. Retirer le tube de l’aimant et ajouter 1 mL de RT RPMI. Mélanger les cellules et les perles 5 fois avec la pipette.
18. Répétez l’étape 2,16, en plaçant le surnageant dans le même tube. Mélangez bien et prenez un échantillon de 20 μL pour compter les cellules
    Remarque: Gardez le tube sur la glace.
19. Centrifugez les cellules 4^-/Cd161a⁺ pendant 10 min, 400 x g à 4oC, puis enlevez le surnageant. Resuspendre les cellules dans le RPMI (10% FBS, 1% PEN/STREP, 2 ng/mL IL-2) et les semences à une concentration de 3 x 10⁵ cellules/puits dans une plaque de 6 puits dans 2,5 ml de support d’activation de cellules NK. Incuber les cellules pour 48 h à 37 ° c, 5% CO₂ dans un incubateur humidifié.

3. dosage de la cytotoxicité: récupération des cellules NK ou YAC1 de la culture ou des cellules de passage

Remarque: Toutes les étapes doivent être conduites sous le capot. Tous les tubes de cellules doivent être maintenus sur la glace en tout temps.

1. Utilisez un pipettage sérologique en verre pour collecter les cellules YAC1 et les milieux de la fiole, placez-les dans un tube de 50 mL sur la glace et mélangez bien. Prenez 20 μL pour compter les cellules.
2. Faire tourner les cellules YAC1 pendant 10 min à 300 x g et 4 ° c. Comptez les cellules pendant que celles-ci tournent.
3. Ajouter la trypsine/EDTA à chaque puits dans une plaque de 6 puits de la cellule NK. Tapotez la plaque et placez-la dans l’incubateur.
4. Après que les cellules ont incubé avec Trypsin/EDTA pendant ~ 5 min à 37 ° c, gratter la plaque/fiole avec un grattoir de plaque stérile. Ajouter 1 mL de NK Cell Media à chaque puits.
5. Collectez des cellules et des milieux avec une pipette sérologique et collectez-les dans un tube de centrifugation de 15 mL. Prenez 20 μL pour compter les cellules.
6. Faire tourner les cellules NK pendant 10 min, 400 x g à 4 ° c. Comptez l’échantillon de cellules de l’étape 3,5 pendant cette centrifugation.
   Remarque: Voir les plaques de culture sous un microscope avant de les jeter pour s’assurer qu’il n’y a plus de cellules adhérant au fond des puits. Puisque l’expérience utilise des cellules NK et des cellules YAC1, assurez-vous de compter chacun séparément.
7. Compter les cellules et les resuspendre aux concentrations déterminées dans les essais d’optimisation pour tester le nombre approprié de ratio cible: effecteur. Ceci sera obtenu en résuspendant le culot dans les milieux correspondants pour faire les concentrations cellulaires suivantes: YAC1 à 4 x 10⁵ cellules/ml et cellules NK à 2 x 10⁷ cellules/ml.

4. dosage de la cytotoxicité: Protocole de dosage

1. Utiliser un fond rond, la culture traitée plaque 96-Well pour mettre en place la plaque comme suggéré dans le tableau 1. Ce tableau montre les contrôles expérimentaux et 3 ensembles de colonnes expérimentales NK. Ceci peut être étendu à un total de 10 colonnes expérimentales NK dans une plaque de 96 puits.
2. Centrifuger la plaque d’essai à 250 x g pendant 4 min pour être certain que l’effecteur et les cellules cibles sont en contact. Incuber la plaque 96-Well pendant 5 heures dans un incubateur humidifié de chambre à 37 ° c, 5% CO₂ pour obtenir un ample contact entre les cellules cibles et effecteurs et la lyse cellulaire cible par les cellules effectrices.
   Remarque: Le protocole peut être suspendu ici.
3. 45 min avant la récolte des surnageants, ajouter 10 μL de solution de lyse 10x dans les puits de libération maximale LDH de la cellule cible (puits 1E, 1F, 1G et 1H) et remettre la plaque dans la chambre humidifiée.
4. Une fois le temps d’incubation terminé, Centrifugez la plaque à 250 x g pendant 4 min. à l’aide d’un pipetteur multicanal, transférez 50 μL d’aliquotes de tous les puits vers une plaque d’essai à fond plat de 96 puits fraîche.
   Remarque: Ne touchez pas le fond des puits pour que les cellules ne soient pas transférées dans la plaque d’essai fraîche. Ne pas utiliser de plaque de culture traitée comme plaque d’essai fraîche.
5. Faire un réactif de dosage.
   1. Après le tampon de dosage a atteint la température ambiante, ajouter 12 mL de tampon de dosage à une bouteille de substrat Mix. Inversez et secouez doucement jusqu’à dissolution complète. 1 bouteille suffit pour 2 96 plaques de puits.
      Remarque: Le tampon de dosage doit être protégé de la lumière tout en étant dégelé. Mélanger immédiatement avant l’utilisation.
6. Ajouter 50 μL de réactif de dosage à tous les puits de la plaque d’essai à partir de l’étape 4,6. Recouvrir la plaque d’une feuille de papier pour la protéger de la lumière et incuber pendant 30 min à température ambiante.
   Remarque: Le réactif de dosage nouvellement fabriqué doit être stocké dans un congélateur. Le réactif est bon pendant environ 8 semaines.
7. Ajouter 50 μL de solution d’arrêt à chaque puits. Lire la plaque dans 1 heure après avoir ajouté la solution d’arrêt et enregistrer l’absorbance à 490 nm. Les données représentatives sont présentées dans le tableau 2.

5. calcul des résultats

1. Calculez la valeur moyenne de l’absorbance à partir des puits de fond de milieu de culture et soustrayez de toutes les valeurs d’absorbance pour les puits expérimentaux, les cellules cibles spontanées de libération de LDH et les cellules effectrices spontanées de libération de LDH.
2. Calculez les valeurs moyennes d’absorbance pour les puits de contrôle de correction de volume et soustrayez des valeurs d’absorbance acquises pour les puits de contrôle de libération maximale de la cellule cible LDH.
3. Utilisez les valeurs corrigées des étapes 5,1 et 5,2 dans la formule suivante pour calculer le pourcentage de cytotoxicité pour chaque effecteur: puits cible.
   

Résultats

Les cellules NK placentaires obtenues à partir de rats NP et RUPP ont été incubées pendant 5 h avec des cellules cibles dans leurs médias respectifs, à un ratio de 50:1 (NK: target). L’absorbance a été enregistrée à 490 nm et les données brutes sont indiquées dans le tableau 2. On a calculé l’absorbance moyenne du fond de milieu de culture et des puits de contrôle de correction de volume. Ces moyennes ont été soustraites des puits appropriés indiqués dans le protocole du fabricant e...

Discussion

Il y a un certain nombre de notes clés importantes à considérer pour des résultats optimaux. La stérilité des cellules utilisées est très importante. Après la collecte du placenta, il est important que la préparation et l’isolement des cellules NK soient effectuées dans des conditions stériles dans un cabinet de biosécurité. En outre, parce que toutes les cellules libèrent LDH sur les dommages cellulaires, il faut prendre soin d’obtenir une grande viabilité des cellules NK après l’isolement et Pend...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Eppendorf tube	Fisher	5408129
100 µL Filter	Fisher	22363549	Nylon Mesh
15 mL conical tube	Fisher	0553859A
3 mL syringe	Fisher	14823436
50 mL conical tube	Fisher	7203510
6-well cell culture plate	Corning	720083
96-well Tissue Culture Plate	CELLTREAT	229190	Sterile, Round Bottom
AOPI	Nexcelom	CS201065ML
Cell scraper	Fisher	8100241
Cellometer Disposable Counting Chambers	Nexcelom	CHT4-SD100
Cellometer Vision Image Cytometer	Nexcelom	N/A
Cytotox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit	Promega	G1780
Dynabeads Flowcomp Flexi Kit	Invitrogen	11061D
DynaMag-2 Magnet	Invitrogen	12321D
EDTA	Sigma Aldrich	EDS-100G
FBS	Atlanta Biologicals	S11150H
Flow Cytometry Tube	Corning	352008
Lymphoprep	Fisher	NC0460539	Density gradient medium; 4 x 250 mL
PBS	Fisher	SH3025801	10 x 500 mL
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140122
Petri dishes	Fisher	9720500	Without Pad
Purified Mouse anti-Rat CD161a	BD Biosciences	555006
Purified Mouse anti-Rat CD3	BD Biosciences	554829
Recombinant Rat IL-2	R&D Systems	502-RL
RPMI	Gibco	11875135	1640 Medium
T25 flask	Corning	430639
Trypsin	ThermoFisher	15090046
YAC-1 cell	ATCC	TIB-160