Rat placental doğal katil hücre Cytolytic fonksiyon değerlendirilmesi için bir plaka tabanlı sitotoksisite assay

Özet

Burada, doğal katil hücrelerin sitotoksisik fonksiyonunu renkmetrik plaka tahlili ile plasenta satıyor 'dan izole etmek ve değerlendirmek için ayrıntılı bir metodoloji sağlıyoruz. Plasental iskemi azaltılmış uterus perfüzyon basınç sıçan modeli antikor aracılı yalıtım ve doğal katil hücrelerin sitotokleş fonksiyonunun değerlendirilmesi göstermek için seçildi.

Özet

Bu desidual doğal katil (NK) hücrelerin kurulması ve normal gebelik bakım kritik bir rol oynarlar bilinmektedir. Son çalışmalar, tekrarlayan düşük ve preeklampsi gibi olumsuz gebelik komplikasyonlarından muzdarip kadınlarda dolaşan ve desidual NK hücrelerinin değiştirilmiş bir nüfusunu göstermiştir. Grubumuzun çalışmaları, gebelikte hipertansiyon, yüzey aktivasyon işaretçileri ifadesine dayalı plasenta aktif NK hücrelerinin artan bir nüfus ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Bu makalede, cerrahi olarak indüklenen plasental iskemi preeklampsi benzeri bir hayvan modelinde plasenta satıyor izole NK hücrelerinin sitotokezik fonksiyonunu değerlendirmek için ayrıntılı bir protokol sağlanmaktadır. Aşağıdaki adımlar ayrıntılı olarak açıklanmıştır: tek hücreli süspansiyon üretimi, NK hücre yalıtımı, ex vivo stimülasyon, effector: hedef hücre Co-Culture, ve sitotoksisite tahlil.

Giriş

Preeklampsi fetal büyüme kısıtlaması, son organ hasarı ve kronik bağışıklık aktivasyonu ile karakterize gebelik hipertansif bir hastalıktır. Preeklampsi olan kadınlarda kronik bağışıklık aktivasyonu artan dolaşım ve plasental inflamatuar sitokinlerin yol açar, CD4⁺ T hücreleri nüfus bir dengesizlik, ve aktif doğal katıl (NK) hücrelerin artan bir nüfus¹. Laboratuvarımız tarafından son yayınlanan çalışmalar, preeklampsi azaltılmış uterin perfüzyon basıncı (RUPP) sıçan modelinde preeklampsi ile ilişkili bazı Patofizyoloji neden olan NK hücreleri için bir rol gösteriyor. NK hücrelerinde harekete geçirmek işaretçilerinin yüzey ifadesini ölçmek için Akış sitometrisi kullanarak, normal hamile (NP) farelerine kıyasla Rupp farelerinin dolaşım ve plasenta satıyor aktif NK hücrelerinin artan bir nüfus görüldü².

Akış sitometri gözlemlerini onaylamak için, NP ve Rupp fareler plasenta satıyor izole NK hücrelerinin sitotokezik aktivitesini değerlendirmek için fonksiyonel çalışmalar yapıldı. Sitotoksisik CD8⁺ T HÜCRELERININ ve NK hücrelerinin sitotokezik fonksiyonunun değerlendirilmesi için çeşitli yöntemler mevcuttur. Fonksiyonel sitotoksisik analiz için altın standardı krom salınım tahlil³. Kullanılan diğer gelişmiş protokoller arasında akış sitometri⁴, görüntü sitometri⁵, calcein sürüm⁶ve en son biyolüminesans⁷yer aldı. Bu video, ticari olarak kullanılabilen bir LDH sitotoksisite assay kiti kullanılarak NK hücrelerinin sitotoksisik fonksiyonunu ölçmek için iyi kurulan lakdamak dehidrojenaz (LDH) serbest bırakma tahlil kullanarak ayrıntılı bir protokol sağlayacaktır.

Protokol

Tüm protokoller Mississippi Tıp Merkezi Üniversitesi 'nde kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır. Hayvanların bakımı ve kullanımı, etik Hayvansal tedavi için Ulusal Sağlık Enstitüleri kurallarına uygun idi.

1. Placentas 'tan lenfosit hücre yalıtımı

1. Bir plasenta fare uterusundan (gebelik günü 19) çıkarın ve 10 mL buz soğuk PBS⁸' de yerleştirin.
2. Bir 100 μm filtre üzerine bir plasenta yerleştirin ve 13,5 mL RPMı ve 1,5 mL FBS içeren bir petri çanak oturmak (toplam hacmi 15 mL). Plasenta filtreden Petri tabağına itmek için bir şırınga pistonun düz tarafını kullanın.
3. Her doku için 3 15 mL konik tüpler hazırlayın. Her tüp için 3 mL yoğunluk degrade Orta ( malzeme tablosunabakın) ekleyin, sonra dikkatle her tüp içine homojenize plasenta 5 ml bindirme.
4. 300 x g olarak oda SıCAKLıĞıNDA (RT) frensiz 25 dk Santrifüjü. Bir transfer pipet ile ince beyaz Buffy tabakası toplayın.
   Not: Santrifüjleme sonrası 3 kat görülebilir, üstte kırmızı RPMI, ortasında beyaz Buffy katmanı ve altta net yoğunluk degrade orta tabaka. Tüpten beyaz Buffy tabakasını çekmek için bir transfer pipet kullanın. Aynı plasenta tüm tüpleri 1 tüp içine Buffy tabaka birleştirin.
5. Buffy katmanlarını kombine etmek için 10 mL RPMı ekleyin. Santrifüjü 10 dak, 300 x g, 4 °c ' de ve supernatant atın.

2. doğal katil hücrelerinin izolasyonu

1. 50 μL buz-soğuk PBS içinde resuspend hücre Pelet
2. Üreticinin protokolüne göre pelleted hücrelere biotin etiketli CD3 antikor ekleyin ve iyi bir pipet ile karıştırın. Tüpü bir Tüp Rotator içine yerleştirin ve 4 °C ' de 20 dakika Inküye yapın.
3. RPMı 1 mL, 400 x g ve 4 °c ' de 10 dakika Santrifüjü ekleyin ve supernatant atın.
4. 1 mL RPMI içinde resuspend Pelet ve 1,5 mL mikrosantrifüj tüpte 150 μL manyetik boncuk ile birleştirin. Mikrosantrifüjün tüpünü bir Tüp Rotator 'a yerleştirin ve 4 °C ' de 30 dakika boyunca inlerken döndürün.
   Not: Şu anda serbest tampon çekin ve biyogüvenlik kabine RT ulaşmak için izin verin.
5. Mıknatıs içinde 1 dakika için tüpler yerleştirin. süpernatant toplamak ve buz üzerinde 15 ml tüp CD3-hücre nüfusu kaydedin.
   Not: Bu hücrelerin CD3^- nüfus olduğunu.
6. Manyetik tüp çıkarın ve RPMı 1 mL ekleyin. Bir pipet ile 5 kez hücreleri ve boncukları karıştırın.
7. 2,5 adımı yineleyin.
8. 400 x g ve 4 °c ' de 10 dk IÇIN hücrelerin CD3^- nüfusu Santrifüjü ve supernatant atın. 50 μL buz-soğuk PBS içinde hücre Pelet resuspend
9. Üretici protokole göre CD3 hücrelerine biotin etiketli CD161a antikor ekleyin ve iyi karıştırın. Tüpü bir Tüp Rotator içine yerleştirin ve 4 °C ' de 20 dakika boyunca inküye yapın.
10. RPMı 1 mL, 400 x g ve 4 °c ' de 10 dakika Santrifüjü ekleyin ve supernatant atın. 1 mL RPMI içinde resuspend Pelet ve 1,5 mL mikrosantrifüj tüpte 150 μL manyetik boncuk ile birleştirin.
11. Mikrosantrifüj tüpünü bir Tüp Rotator içine yerleştirin ve 4 °C ' de 30 dakika boyunca inlerken döndürün.
12. Tüpleri 1 dakika boyunca mıknatıslı yerleştirin. süpernatant toplayın ve CD3^-/cd161a^- hücreleri atın.
13. Mıknatıslı tüp çıkarın ve RPMı 1 mL ekleyin. Bir pipet ile 5 kez hücreleri ve boncukları karıştırın.
14. 2,12 adımı yineleyin.
15. Mıknatıslı mikrosantrifüj tüpleri çıkarın ve 1 mL RT serbest bırakma tamponu ekleyin. Tube Rotator üzerinde tüp yerleştirin ve RT 15 dakika boyunca inkübe ederken döndürün.
16. 1 dakika boyunca mıknatıslı yerleştirin. buz üzerinde yeni bir 15 ml konik tüp süpernatant toplayın.
    Not: Bu NK hücrelerinin nüfusu.
17. Mıknatıslı tüpü çıkarın ve 1 mL RT RPMı ekleyin. Pipet ile 5 kez hücreleri ve boncukları karıştırın.
18. Aynı tüp içinde süpernatant yerleştirerek, adım 2,16 tekrarlayın. İyi karıştırın ve hücreleri saymak için 20 μL örnek alın
    Not: Tüp buz üzerinde tutun.
19. Santrifüjlü CD3^-/Cd161a⁺ hücreleri 10 dak, 400 x g de 4 °c, sonra supernatant çıkarın. RPMI (% 10 FBS, 1% pen/strep, 2 ng/mL IL-2) ve tohum 3 x 10⁵ hücreler/iyi bir 6-iyi plaka Içinde 2,5 ml NK hücre aktivasyon medya bir konsantrasyonda hücreleri resuspend. 37 °C ' de 48 h için hücreleri kuluçsa,% 5 CO₂ nemlendirilmiş bir inkükote.

3. sitotoksisite tahlil: NK hücreleri veya YAC1 kültür veya Passing hücreler alma

Not: Tüm adımlar kaput altında yapılmalıdır. Tüm hücre tüpleri buz üzerinde her zaman tutulmalıdır.

1. YAC1 hücre ve medya Flask toplamak için bir cam serolojik pipet kullanın, buz üzerinde bir 50 mL tüp yer, ve iyi karıştırın. Hücreleri saymak için 20 μL alın.
2. 300 x g ve 4 °c ' de 10 dakika YAC1 hücrelerini döndürün. Bunlar dönmeye çalışırken hücreleri saymak.
3. Her iyi bir NK hücre 6-kuyu plaka Trypsin/EDTA ekleyin. Plakaya dokunun ve inküvatör yerleştirin.
4. Hücreler 37 °C ' de ~ 5 dakika için tripsin/EDTA ile inkübe edildikten sonra, plaka/Flask 'ı steril bir plaka sıyırıcı ile kazıyın. Her iyi NK Cell Media 1 mL ekleyin.
5. Serolojik pipet ile hücreleri ve medyayı toplayın ve 15 mL santrifüj tüpte toplayın. Hücreleri saymak için 20 μL alın.
6. NK hücrelerini 4 °C ' de 10 dakika, 400 x g 'ye döndürün. Bu santrifüjleme sırasında 3,5 adımından gelen hücrelerin örneğini saymak.
   Not: Daha fazla hücre kuyuların altına yapışmış olduğundan emin olmak için onları atarak önce bir mikroskop altında kültür plakaları görüntüleyin. Deneme NK hücreleri ve YAC1 hücreleri kullandığından, her birini ayrısaytığınızdan emin olun.
7. Uygun hedef sayısı için test etmek için optimizasyon denemeleri belirlenen konsantrasyonlarda hücreler ve pelletini Count: effector oranı. Bu, aşağıdaki hücre konsantrasyonlarını yapmak için ilgili medyada Pelet yeniden askıya tarafından elde edilecektir: YAC1 at 4 x 10⁵ hücreler/ml ve NK hücreleri 2 x 10⁷ hücreler/ml.

4. sitotoksisite tahlil: tahlil Protokolü

1. Bir yuvarlak alt kullanın, kültür 96-Well plaka Tablo 1' de önerilen plaka kurmak için tedavi. Bu tablo deneysel kontroller ve NK deneysel sütunların 3 setleri gösterir. Bu, 96-Well plakasında toplam 10 NK deneysel sütuna genişletilebilir.
2. Test plakasını 250 x g 'de santrifüjle 4 dakika boyunca efektör ve hedef hücrelerin temas halinde olduğundan emin olun. 96-kuyu plakasını, 37 °C ' de,% 5 CO₂ ' de nemlendirilmiş bir oda inkükodiye 5 saat boyunca, hedef ve efektör hücreleri ve hedef hücre liziz arasında efektör hücrelerine kadar temas sağlamak için.
   Not: Protokol burada duraklatılmış olabilir.
3. 45 dakika önce hasat Supernatants, 10 μL 10X Lysis solüsyonu hedef hücreye maksimum LDH yayın kuyuları (Wells 1E, 1F, 1G ve 1s) ekleyin ve plaka geri nemlendirilmiş odasına yerleştirin.
4. İnkübasyon süresi tamamlandıktan sonra, plakayı 250 x g 'de 4 dakika boyunca santrifüjler, çok kanallı bir pipettor kullanarak, tüm kuyulardan 50 μL plakaya yeni bir 96-iyi düz-alt assay plakaya aktarın.
   Not: Hücrelerin taze tahlil plakasına transfer edilmemesi için kuyuların altına dokunmayın. Taze tahlil plaka olarak bir kültürlü tedavi plaka kullanmayın.
5. Tahlil Reakajı yapın.
   1. Assay tampon oda sıcaklığına ulaştı sonra, bir substrat Mix şişe tahlil tampon 12 mL ekleyin. Tamamen çözülene kadar yavaşça ters çevirin ve sallayın. 2 96-kuyu plakaları için 1 şişe yeterlidir.
      Not: Tahlil tampon çözülürken ışık korunmalıdır. Kullanımı hemen önce karıştırın.
6. 50 adım 4,6 test plakasında tüm kuyulara assay Reakajının μL ekleyin. Işığı korumak ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inküye için folyo ile plaka kapak.
   Not: Yeni yapılan assay reaktif bir dondurucuda depolanmalıdır. Reakajın yaklaşık 8 hafta boyunca iyidir.
7. 50 μL dur çözümü her iyi ekleyin. Çözüm durdur eklendikten sonra 1 saat içinde plakayı okuyun ve 490 nm 'de emici kaydedin. Temsili veriler Tablo 2' de gösterilir.

5. sonuçların hesaplanması

1. Kültür orta arkaplan kuyularından ortalama emici değerini hesaplayın ve deneysel, hedef hücre spontan LDH serbest bırakılması ve effector Cell spontan LDH Release Wells için tüm emici değerlerden çıkarın.
2. Birim düzeltme kontrol kuyuları için Ortalama emici değerlerini hesaplayın ve hedef hücre maksimum LDH serbest bırakma kontrolü kuyuları için elde edilen emici değerlerden çıkarın.
3. Her efektör için yüzde sitotoksisite hesaplamak için aşağıdaki formülde Steps 5,1 ve 5,2 düzeltilmiş değerleri kullanın: hedef iyi.
   

Sonuçlar

NP ve RUPP farelerinden elde edilen placental NK hücreler, 50:1 (NK: Target) oranındaki hedef hücreler ile ilgili Medias 'da 5 h için inkübe edildi. Emici 490 nm 'de kaydedildi ve ham veriler Tablo 2' de gösterilir. Kültür orta arka plan ve hacim düzeltme kontrol kuyuları ortalama absorbans hesaplanmıştır. Bu ortalamalar, üreticinin protokolünde belirtilen uygun kuyulardan çıkarılır ve Tablo 3' te temsil edilir. Düzeltilmiş değerler daha sonra üretici tarafından s...

Tartışmalar

En iyi sonuçlar için dikkate alınması gereken önemli notlar bir dizi vardır. Kullanılan hücrelerin sterilitesi çok önemlidir. Plasentanın toplanması sonrasında, NK hücrelerinin hazırlanması ve yalıtımının Biyogüvenlik kabininde steril koşullarda gerçekleştirilmesi önemlidir. Ayrıca, hücresel hasar üzerine tüm hücreler LDH serbest olduğundan, yalıtım sonra ve Co-Culture sürecinde NK hücrelerinin yüksek bir canlılığı elde etmek için bakım alınmalıdır. NK hücrelerinden çok fazl...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Eppendorf tube	Fisher	5408129
100 µL Filter	Fisher	22363549	Nylon Mesh
15 mL conical tube	Fisher	0553859A
3 mL syringe	Fisher	14823436
50 mL conical tube	Fisher	7203510
6-well cell culture plate	Corning	720083
96-well Tissue Culture Plate	CELLTREAT	229190	Sterile, Round Bottom
AOPI	Nexcelom	CS201065ML
Cell scraper	Fisher	8100241
Cellometer Disposable Counting Chambers	Nexcelom	CHT4-SD100
Cellometer Vision Image Cytometer	Nexcelom	N/A
Cytotox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit	Promega	G1780
Dynabeads Flowcomp Flexi Kit	Invitrogen	11061D
DynaMag-2 Magnet	Invitrogen	12321D
EDTA	Sigma Aldrich	EDS-100G
FBS	Atlanta Biologicals	S11150H
Flow Cytometry Tube	Corning	352008
Lymphoprep	Fisher	NC0460539	Density gradient medium; 4 x 250 mL
PBS	Fisher	SH3025801	10 x 500 mL
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140122
Petri dishes	Fisher	9720500	Without Pad
Purified Mouse anti-Rat CD161a	BD Biosciences	555006
Purified Mouse anti-Rat CD3	BD Biosciences	554829
Recombinant Rat IL-2	R&D Systems	502-RL
RPMI	Gibco	11875135	1640 Medium
T25 flask	Corning	430639
Trypsin	ThermoFisher	15090046
YAC-1 cell	ATCC	TIB-160