На основе пластины цитотоксичность анализ для оценки крысы плацентарной естественной клетки убийцы Цитолитические функции

Резюме

Здесь мы предоставляем подробную методологию, чтобы изолировать и оценить цитотоксическую функцию естественных киллеров из плаценты с помощью цветометрического анализа пластины. Снижение маточных перфузионного давления крысы модель плацентарного, был выбран, чтобы продемонстрировать антитело-опосредованной изоляции и оценки цитотоксической функции естественных клеток убийцы.

Аннотация

Хорошо известно, что децидвойные естественные клетки убийцы (НК) играют решающую роль в установлении и поддержании нормальной беременности. Недавние исследования продемонстрировали измененную популяцию циркулирующих и децидуальных НК-клеток у женщин, страдающих от неблагоприятных осложнений беременности, таких как рецидивирующий выкидыш и преэклампсия. Исследования, проведенные нашей группой, показали, что гипертония при беременности связана с увеличением популяции активированных НК-клеток в плаценте на основе экспрессии маркеров поверхностной активации. Данная рукопись представляет собой подробный протокол для оценки цитотоксической функции НК-клеток, изолированных от плаценты в виде животной модели хирургически индуцированной плацентарной иоэклампсии. Ниже описаны следующие этапы: Генерация одноклеточной суспензии, НК-клеточная изоляция, стимуляция в естественных условиях, эффектор: Целевая клеточная сокультура и цитотоксичность.

Введение

Преэклампсия-гипертензивное расстройство беременности, характеризующееся ограничением роста плода, повреждением конечного органа и хронической иммунной активацией. Хроническая иммунная активация у женщин с преэклампсией приводит к увеличению циркулирующих и плацентарных воспалительных цитокинов, дисбаланс в CD4⁺ т-клеток населения, и увеличение популяции активированных естественных киллеров (НК) клеток¹. Исследования, недавно опубликованные нашей лабораторией, демонстрируют роль НК-клеток в возникновении некоторых патофизиологии, ассоциируемых с преэклампсией в «уменьшении давления маточных перфузии» (Рапп), модели преэклампсии. Использование потока цитометрии для измерения поверхностного выражения маркеров активации на НК-клеток, увеличение популяции активированных НК-клеток в обращении и плаценты Рапп крыс по сравнению с нормальным беременных (НП) крысы наблюдались².

Для подтверждения наблюдений за потоком цитометрии были выполнены функциональные исследования для оценки цитотоксической активности НК-клеток, выделенных из плаценты НП и крыс РУППП. Существует несколько методов оценки цитотоксической функции цитотоксических CD8⁺ т-клеток и НК-клеток. Золотым стандартом функционального цитотоксического анализа является анализ высвобождения хрома³. Другие разработанные протоколы, используемые включают поток цитометрия⁴, изображение цитометрии⁵, calcein релиз⁶, и совсем недавно биолюминесценции⁷. Это видео будет предоставлять подробный протокол об использовании хорошо наладившейся лактата дегидрогеназы (LDH) релиз анализа для измерения цитотоксической функции НК-клеток с использованием коммерчески доступных LDH цитотоксичность анализа комплекта.

протокол

Все протоколы были одобрены институциональным Комитетом по уходу и использованию животных в медицинском центре Университета Миссисипи. Уход и обработка животных были в согласии с национальными институтами здоровья руководящие принципы для этичного лечения животных.

1. изоляция клеток лимфоцитов от плаценты

1. Удалите одну плаценту от крысиной матки (день беременности 19) и поместите в 10 мл ледяной PBS⁸.
2. Поместите одну плаценту на фильтр 100 мкм и сядьте в чашку Петри, содержащую 13,5 мл RPMI и 1,5 мл ФПС (общий объем 15 мл). Использование плоской стороне шприц поршень, чтобы подтолкнуть плаценту через фильтр в чашку Петри.
3. Подготовьте 3 15 mL конические трубы для каждой ткани. Добавьте 3 mL градиент плотности среднего (см. таблицу материалов) к каждой трубке, после этого тщательно наложи 5 мл однородности плаценты в каждую трубку.
4. Центрифуга на 25 мин при температуре 300 х г при комнатной температуры (RT) без тормозов. Соберите тонкий белый охристым слоем с передачей пипетки.
   Примечание: После центрифугирования, 3 слоя видны, красный RPMI наверху, белый охристые слои в середине, и четкий градиент плотности среднего слоя внизу. Используйте передачу пипетки, чтобы подтянуть белый охристые слой из трубки. Комбинат Баффи слой из всех труб из той же плаценты в 1 трубу.
5. Добавьте 10 мл RPMI в комбинированные охристые слои. Центрифуга на 10 мин, 300 х г, при температуре 4 °c, и отказаться от супернатант.

2. изоляция естественных клеток убийцы

1. Ресуспензируем ячейки гранул в 50 мкл ледяной PBS
2. Добавить биотин-маркировку CD3 антитела к гранулированных клеток в соответствии с протоколом производителя и хорошо перемешать с пипетки. Поместите трубку в трубку ротатора и инкубации 20 мин при температуре 4 ° c.
3. Добавьте 1 мл RPMI, центрифугу на 10 мин при 400 х г и 4 °c и откажитесь от супернатант.
4. Ресуспензируем гранулы в 1 мл RPMI и сочетать с 150 мкл магнитных бусин в 1,5 мл трубки микроцентрифуги. Поместите пробирку микроцентрифуги в трубку ротатора и вращайте при инкубации в течение 30 минут при температуре 4 ° c.
   Примечание: В это время вытащите буфер высвобождения и позвольте достичь RT в кабинете биобезопасности.
5. Поместите трубы в магнит на 1 мин. Соберите супернатант и сохраните населенность CD3-клетки в пробке 15 ml на льдах.
   Примечание: Это CD3^- популяция клеток.
6. Снимите трубку с магнита и добавьте 1 мл RPMI. Смешайте клетки и бисер 5 раз с пипетки.
7. Повторите шаг 2,5.
8. Центрифуга CD3^- популяции клеток в течение 10 мин при температуре 400 х г и 4 °c и сбросьте supernatant. Ресуспензируем ячейки гранулы в 50 мкл ледяной PBS
9. Добавить биотин-помечены антитела CD161a к CD3^- клеток в соответствии с протоколом производителя и хорошо перемешать. Поместите трубку в трубке ротатора и инкубировать в течение 20 минут при температуре 4 ° c.
10. Добавьте 1 мл RPMI, центрифугу на 10 мин при 400 х г и 4 °c и откажитесь от супернатант. Ресуспензируем гранулы в 1 мл RPMI и сочетать с 150 мкл магнитных бусин в 1,5 мл трубки микроцентрифуги.
11. Место трубки микроцентрифуга в трубке ротатора и вращать при инкубации в течение 30 минут при температуре 4 ° c.
12. Поместите трубки в магнит на 1 мин. Соберите супернатант и выбросите CD3^-/Cd161a^- клетки.
13. Снимите трубку с магнита и добавьте 1 мл RPMI. Смешайте клетки и бисер 5 раз с пипетки.
14. Повторите шаг 2,12.
15. Удалите трубки микроцентрифуг из магнита и добавьте 1 мл буфера выпуска RT. Место трубки на трубе ротатора и вращать при инкубации в течение 15 минут на RT.
16. Поместите трубы в магнит на 1 мин. Соберите супернатант в новой 15 мл конической трубки на льду.
    Примечание: Это население НК-клеток.
17. Снимите трубку с магнита и добавьте 1 мл RT RPMI. Смешайте клетки и бисер 5 раз с пипетки.
18. Повторите шаг 2,16, поместив супернатант в той же трубе. Хорошо перемешать и взять 20 мкл образец для подсчета клеток
    Примечание: Держите трубку на льду.
19. Центрифуга CD3^-/Cd161a⁺ ячейки для 10 мин, 400 х г при температуре 4 °c, затем удалите supernatant. Ресуспензируем клетки в RPMI (10% ФБС, 1% пен/стрептококк, 2 нг/мл IL-2) и семян при концентрации 3 х 10⁵ клеток/хорошо в 6-хорошо пластины в 2,5 мл НК активации ячейки Media. Инкубировать клетки для 48 h на 37 °C, 5% CO₂ в увлажненный инкубатор.

3. цитотоксичность анализ: извлечение НК-клеток или YAC1 от культуры или прохождения клеток

Примечание: Все шаги должны быть проведены под капотом. Все клеточные трубки должны храниться на льду во все времена.

1. Используйте стекло серологических пипетки собрать YAC1 клеток и средств массовой информации из колбы, место в 50 ml трубки на льду, и хорошо перемешать. Возьмите 20 мкл для подсчета клеток.
2. Спин YAC1 клеток в течение 10 минут при 300 х г и 4 °c. Считайте ячейки, пока они вращаются.
3. Добавить трипсин/ЭДТА к каждому хорошо в НК ячейки 6-хорошо пластины. Нажмите на тарелку и поместите в инкубатор.
4. После клетки инкубировали с трипсин/ЭДТА для ~ 5 мин при температуре 37 ° c, царапать пластины/фляжка с стерильной пластины скребком. Добавить 1 мл НК ячейки средств массовой информации для каждого хорошо.
5. Сбор клеток и средств массовой информации с серологических пипетки и собирать в 15 мл трубки центрифуги. Возьмите 20 мкл для подсчета клеток.
6. Спин НК-клеток в течение 10 мин, 400 х г при температуре 4 °c. Подсчитайте образец ячеек из шага 3,5 во время этого центрифугирования.
   Примечание: Вид культуры пластин под микроскопом, прежде чем выбросить их, чтобы убедиться, есть не больше клеток, привязаны к нижней части скважин. Так как эксперимент использует НК-клетки и YAC1 клетки, обязательно считайте каждый отдельно.
7. Подсчитывайте клетки и ресуспензируем на концентрациях, определяем при оптимизации испытаний для проверки соответствующего количества цели: коэффициент эффектора. Это будет достигнуто путем повторного приостановления гранулы в соответствующих средствах массовой информации, чтобы сделать следующую ячейку концентрации: YAC1 на 4 х 10⁵ клеток/мл и НК-клеток при 2 х 10⁷ клеток/мл.

4. цитотоксичность анализ: Протокол анализа

1. Использование круглого дна, культуры лечение 96-хорошо пластины для установки пластины, как это предлагается в таблице 1. В этой таблице показаны экспериментальные элементы управления и 3 комплекта экспериментальных колонн НК. Это может быть расширена в общей сложности 10 НК экспериментальных колонн в 96-хорошо пластины.
2. Центрифуга Пробирной пластины на 250 x g в течение 4 минут, чтобы быть уверенным, что Эффектор и целевые клетки находятся в контакте. Инкубировать 96-хорошо пластины в течение 5 часов в увлажненный инкубатор камеры при 37 ° c, 5% CO₂ для достижения достаточного контакта между целью и эффекторных клеток и лизиза целевой клетки эффекторных клеток.
   Примечание: Протокол может быть приостановлен здесь.
3. 45 мин до уборки supernatants, добавить 10 мкл 10x лизиса решение целевой ячейки максимальная LDH-релиз скважин (Уэллс 1E, 1E, 1E, и 1E) и поместите пластину обратно в увлажненный камеры.
4. После завершения инкубации, центрифуга пластины на 250 x g в течение 4 мин. с помощью мультиканально-трубопроводного, передача 50 мкл aliquототы из всех скважин на свежий 96-хорошо плоско-дно Пробирной пластины.
   Примечание: Не прикасайтесь к дну скважин так, чтобы клетки не передавались в свежую пластину пробирки. Не используйте культивируемые пластины, как свежие пластины анализа.
5. Сделать анализ реагента.
   1. После анализа буфера достигла комнатной температуры, добавить 12 мл пробирного буфера в один субстрат Mix бутылку. Инвертировать и трясти осторожно, пока полностью не растворится. 1 бутылка достаточно для 2 96-хорошо пластин.
      Примечание: Анализ буфера должны быть защищены от света во время оттаивания. Смешайте непосредственно перед использованием.
6. Добавить 50 мкл пробирного реагента ко всем скважинами в пластине пробирки от шага 4,6. Обложка пластины с фольгой, чтобы защитить его от света и инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре.
   Примечание: Недавно сделанный анализ реагента должен храниться в морозильной камере. Реагент хорошо в течение примерно 8 недель.
7. Добавьте 50 мкл стоп-решения каждому хорошо. Прочитайте тарелку в течение 1 часа после добавления стоп-решения и запишите всасывающей абсорбту на 490 Нм. Репрезентативные данные отображаются в таблице 2.

5. расчет результатов

1. Вычислить среднее значение поглощения от культуры средних фоновых скважин и вычитания из всех значений поглощения для экспериментальных, Целевая ячейка спонтанного релиз LDH и Эффэкторных клеток спонтанных скважин LDH релиз.
2. Расчет средних значений абсорбционной для регулировки громкости для управления скважинами и вычитания из значений поглощения, приобретенных для максимального количества LDH-контроля скважин для целевой ячейки.
3. Используйте исправленные значения от шагов 5,1 и 5,2 в следующей формуле, чтобы вычислить процент цитотоксичности для каждого эффектора: цель хорошо.
   

Результаты

Плацентарные НК-клетки, полученные от ПР и РУППА крысы инкубировали в течение 5 ч с целевыми клетками в соответствующих средах в соотношении 50:1 (НК: цель). Абсорбта была записана в 490 Нм, а исходные данные показаны в таблице 2. Рассчитывались средние показатели абсорбцией культур?...

Обсуждение

Существует ряд важных ключевых заметок для рассмотрения для достижения оптимальных результатов. Стерильность используемых клеток очень важна. После сбора плаценты важно, чтобы подготовка и изоляция НК-клеток выполняли в стерильных условиях в кабинете биобезопасности. Кроме того, пос...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Eppendorf tube	Fisher	5408129
100 µL Filter	Fisher	22363549	Nylon Mesh
15 mL conical tube	Fisher	0553859A
3 mL syringe	Fisher	14823436
50 mL conical tube	Fisher	7203510
6-well cell culture plate	Corning	720083
96-well Tissue Culture Plate	CELLTREAT	229190	Sterile, Round Bottom
AOPI	Nexcelom	CS201065ML
Cell scraper	Fisher	8100241
Cellometer Disposable Counting Chambers	Nexcelom	CHT4-SD100
Cellometer Vision Image Cytometer	Nexcelom	N/A
Cytotox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit	Promega	G1780
Dynabeads Flowcomp Flexi Kit	Invitrogen	11061D
DynaMag-2 Magnet	Invitrogen	12321D
EDTA	Sigma Aldrich	EDS-100G
FBS	Atlanta Biologicals	S11150H
Flow Cytometry Tube	Corning	352008
Lymphoprep	Fisher	NC0460539	Density gradient medium; 4 x 250 mL
PBS	Fisher	SH3025801	10 x 500 mL
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140122
Petri dishes	Fisher	9720500	Without Pad
Purified Mouse anti-Rat CD161a	BD Biosciences	555006
Purified Mouse anti-Rat CD3	BD Biosciences	554829
Recombinant Rat IL-2	R&D Systems	502-RL
RPMI	Gibco	11875135	1640 Medium
T25 flask	Corning	430639
Trypsin	ThermoFisher	15090046
YAC-1 cell	ATCC	TIB-160