質量光測定による抗体-抗原アフィニティーの迅速な測定

要約

質量光計測(MP)を用いた抗原抗体親和性測定に対する単一分子アプローチについて述べています。MPベースのプロトコルは、高速で正確で、非常に少量の材料を使用し、タンパク質の改変を必要としません。

要約

抗原と抗体相互作用の特異性と親和性の測定は、医学および研究用途にとって極めて重要です。このプロトコルでは、この目的のために新しい単一分子技術、質量光測定(MP)の実装について説明する。MPは、抗体および抗原抗体複合体の分子質量および集団を単一分子レベルで検出し、定量化する、標識および固定化を含まない技術です。MPは数分以内に抗原抗体サンプルを分析し、結合親和性の正確な決定を可能にし、同時にタンパク質のストイキオメトリーとオリゴマー状態に関する情報を提供します。これは、タンパク質のピコモール量と高価な消耗品を必要としないシンプルで簡単な技術です。同じ手順を使用して、50 kDaを超える分子量を持つタンパク質に対するタンパク質結合を研究することができます。多価タンパク質相互作用の場合、複数の結合部位の親和性を単一の測定で得ることができる。しかし、測定の単一分子モードと標識の欠如は、いくつかの実験的な制限を課します。この方法は、サブマイクロモル相互作用親和性、20kDa以上の分子質量を持つ抗原、および比較的純粋なタンパク質サンプルの測定に適用すると最良の結果を与えます。また、基本的なデータ解析ソフトを用いて、必要なフィッティング・計算手順を実行する手順についても説明します。

概要

抗体は分子生物学のユビキタスツールとなり、医学と研究の両方の用途で広く使用されています。医学では、診断において非常に重要であるが、治療用途も拡大しており、新しい抗体ベースの治療法は常に^{1、2、3、4}を開発されている。抗体の科学的応用には、免疫蛍光^5、免疫沈降^6、フローサイトメトリー7、ELISA、およびウェスタンブロッティングなどの多くの不可欠な実験室技術が含まれる。これらのアプリケーションのそれぞれについて、結合親和性や特異性を含む抗体の結合特性の正確な測定を得ることは非常に重要です。

1990年に初の市販表面プラズモン共鳴(SPR)装置が導入されて以来、光学バイオセンサーは抗体特性の「ゴールドスタンダード」となっているが、ELISAを含む他の技術も抗体親和性^8,9を測定するために日常的に使用されている。これらの方法は、通常、分析された分子の固定化または標識を必要とし、潜在的に関心のある相互作用に影響を与える可能性がある。また、データ分析のために結果を収集する前に複数のアッセイステップを含む比較的遅いです。最近開発された単一分子法である質量光測定法(MP)は、顕微鏡カバースリップ^10,11の表面に着地したときに溶液中の分子を直接検出する。MPが採用する光散乱ベースの光学検出では、タンパク質の標識や修飾は必要ありません。個々のタンパク質分子は、画像に現れる暗い斑点として干渉散乱顕微鏡によって記録され(図1D)、そして1分間のデータ取得¹²の間に数千個の分子が検出できる。個々のパーティクルによって生成される信号が定量化され、そのコントラスト値(相対暗さ)が計算されます。干渉的なコントラスト値はタンパク質の分子質量に比例し、抗原抗体混合物中の結合種と遊離種の同定を可能にする。同時に、分子着陸事象を数えることによって、MPは種の個体数を直接測定する。これにより、MP ベースのメソッドは、複数の結合部位の親和性を個別に定量化する独自の機能を提供します。

抗原(Ag)分子のインタクト抗体の2つの結合部位(Ab)への結合は、以下のように記述できます。

平衡関連定数Ka1 およびK_a2は次のように定義されています。

ここで、c_iと f i_{はそれぞれ}成分iの濃度と分数を表します。総抗原濃度(c_Ag)トットは以下のように表現できます。

抗体(c_Ab)トットと抗原(c_Ag)ト_ットの全濃度が知られているので、この式を用いてMP測定から得られた分画を直接適合させ、平衡関連定数K_a1および_Ka2を計算することができる(補足情報を参照)。

MPデータは、2つの抗体結合部位¹¹間の協同率を推定するためにも使用できる。同一微視的結合定数を有する2つの抗体パラトープについて、Abの集団の過程を記述する統計的因子 ·アグとアブ·Ag2複合体は、見かけの巨視平衡定数K_a1と_Ka2は数値的に等しくないことを指示し、K_a1= 4K_a2。 従って、K_a1< 4K_a2の実験値は、2つの抗体結合部位間の正の協同性を示す。同様に、K_a1 > 4K_a2は負の協同率を示す。

抗原抗体結合親和性のMP測定は速く、少量の材料を必要とする。平衡定数計算に使用されるMP質量分布は、サンプル特性に関する追加情報を提供し、サンプルの純度、オリゴマー化、および凝集を1回の実験で評価できるようにします。同じ方法を使用して高親和性タンパク質-タンパク質結合を測定することができ、MPは、多価タンパク質相互作用の研究に特に有用である。多タンパク質複合体は通常、MP検出に最適な分子量が大きく、一分子データを使用して、ストイチオメトリーを測定し、複数の結合部位の親和性を同時に計算することができます。この情報は、通常、バルク ベースのメソッドを使用して取得するのが困難です。

改変無しの現在のプロトコルは、20kDa以上の分子質量の抗原との比較的高親和性、サブマイクロモル相互作用の測定に適しています。最適な結果を得るには、タンパク質ストックは高純度である必要がありますが、特定のバッファー要件はありません。MPを用いることによって、抗原抗体結合は5分未満で評価することができる。正確なKd計算に必要なデータ収集と分析は、30分以内に実行できます。

プロトコル

1. 流れチャンバを準備する

1. ガラスカバーリップをクリーニングする
   1. 蒸留水、エタノール、イソプロパノールを含む洗浄ボトルを使用して、水、エタノール、水、イソプロパノール、水の順序で24 mm x 50 mmのカバーリップを洗い流します。きれいな窒素の流れでカバースリップを乾燥させます。下の角を柔らかい先端の鉗子で押さえて、カバーリップを上から下にすすい込むのが重要です。カバースリップを同じ方向に乾かして、鉗子からの汚染を移動させないようにします(図2A)。
   2. 同様に、24 mm x 24 mm のカバーリップを蒸留水、エタノール、蒸留水でリンスします。きれいな窒素の流れでカバースリップを乾燥させます。
   3. カバースリップの作業側を特定し、きれいなカバースリップの表面に蒸留水を一滴置き、プロトコルのステップ3.1-3.2に従います。通常、24 mm x 50 mm カバースリップの片側にのみ、MP 測定に適した光学品質があります。
      注: フォーカス後、重大な表面の欠陥を検出でき、データ収集ソフトウェアに示されている「シグナル」値は 0.05% 未満である必要があります (図 1A-C)。ボックス内のすべてのカバーリップの作業面は、同じ方向に向いています。カバースリップクリーニングの効率をテストするために同じ手順を使用する必要があります。
2. 流れチャンバを組み立てる
   1. 24 mm x 24 mm のカバースリップをアルミホイルの上に置きます。図2Bに示すように、両面テープのストリップを24mm x 24mmのカバースリップの上に置き、ガラスの端に沿ってテープを切ります。カバースリップをアルミホイルから分離し、24 mm x 50 mm カバースリップの作業側に取り付けます(図 2C)。
      メモ:チャンネルサイズは異なりますが、幅は3mm~5mmにすることをお勧めします。より広いチャネルは、より大きなサンプルボリュームを必要とし、非常に狭いチャネルはロードするのが難しい場合があります。通常、24 mm x 24 mm のカバースリップで 2 つのパラレル チャネルを簡単に作成できます。プロトコルはここで一時停止することができます。

2. アフィニティー測定用に抗体抗原サンプルを準備する

1. 0.22 μmシリンジフィルターを使用してPBSバッファーの少なくとも2 mLをフィルターして、ほこり粒子または凝集体を除去します。卓上遠心分離機の最高速度で10分間タンパク質ストックを遠心分離する(約16,000 x g)。
   注: PBS はこのプロトコルの推奨バッファですが、MP には特定のバッファ要件はなく、他の生物学的バッファも許容されます。しかし、グリセリン濃度が高い(>10%)非常に低いイオン強度(塩濃度<10 mM)は画像とデータ品質に影響を与える可能性があり、推奨されません。
2. 280 nm UV吸光度を測定して、抗体および抗原ストックの実際の濃度を決定します。
3. 抗原抗体混合物の測定濃度を計算する。抗体結合親和性の推定値が不明な場合、30nM抗原および20nM抗体濃度の試料を調製する計画を立てる。近似親和性が既知である場合、抗体と抗原比、およびそれらの濃度は、期待されるKd値に従って最適化されるべきである。以下の式で、予想されるKdと抗体濃度の合計と等しい混合物中の全抗原濃度を使用する。抗体の2つのパラトープに対して_Kd1=Kd2と仮定すると、これはサンプル中の遊離抗体と抗体抗原複合体の同等の濃度をもたらす。
   
   抗体濃度を調整して、サンプル中のタンパク質の全濃度を10 nMおよび50 nMの範囲内に保ちます。最良の結果は、5 nMと25 nMの間の抗体濃度を有する混合物を使用して得られる。
   注:MPは、40 kDaを超える分子量のタンパク質を検出します。その結果、40kDa未満の分子質量を有する抗原のサンプル濃度は、典型的な50 nM限界を超えることができる。しかし、約100nMより高い濃度では、低分子質量抗原であっても、Kd測定の画質や精度に影響を与える可能性があります。
4. ステップ2.3で計算した最終測定濃度で抗体-抗原混合物の50 μLを調製する。
   注 :K_d の決定には抗原抗体混合物のサンプルが1つだけ必要です。しかし、抗体比が異なる複数のサンプルを調製することで、サンプル濃度を最適化できます。複数のサンプルのデータが収集された場合、グローバルフィットを使用して分析できます。
5. 抗原抗体混合物を室温で約10分間インキュベートし、結合反応が化学平衡に達することを可能にします。不必要に長い潜伏時間を避けてください。
   注:インキュベーション時間は、結合動力学によって異なる場合があります。化学平衡に達したことを確認するために、サンプル測定は異なるインキュベーション時に繰り返すことができる。時間不変量Kd値は十分に長いインキュベーションを示す。長時間のインキュベーションは、プラスチックラボウェアの表面に有意なタンパク質吸着をもたらし、その結果、タンパク質濃度決定において重大な誤りをもたらす可能性がある。このため、MPサンプル調製¹³には低接着ラボウェアを強くお勧めします。

3. 質量光測定データを収集する

1. MP機器の目的に顕微鏡浸漬油の滴を塗布し、顕微鏡のステージ上に組み立てられた流れチャンバーを置きます。オイルがカバースリップと目的の間のギャップにまたがっていることを確認してください。
2. 流れチャンバをロードし、質量光度計を集中させます。
   1. ステップ1で調製したフローチャンバチャネルの一端に、清潔で濾過されたバッファ溶液の10μLを堆積する。液体は毛細血管作用によってチャネルに入ります。
   2. ステージのZ位置を調整して、24 x 50 mmカバースリップの作業面に顕微鏡を焦点を合わせます。
      1. データ収集ソフトウェアの [フォーカス制御 ]タブで、粗いステージの動き の上 と 下の ボタンを使用して、初期調整を行います。
      2. シャープネスボタンをクリックしてシャープネス信号の読み出しを表示し、細かい上矢印と下の調整ボタンを使用してシャープネスの値を最大化します。
      3. フォーカスの 設定 ボタンと フォーカスのロック ボタンをクリックして、フォーカス追跡機能を有効にします。適切に焦点を合わせるイメージ (図 1A,C) の 「シグナル」値は 0.05% 未満でなければなりません。
         注: 最大シャープネスポジションの「シグナル」値が0.05%を超える場合、ガラス表面またはバッファ内の不純物を示している可能性があります。
3. 同じチャネルを使用して、抗体抗原サンプルの20μLをチャネルの片側に堆積させ、他方の端から液体を小さなブロッティングペーパーでブロットすることによって、20μLをロードする(図2D)。
   注:3~5mm幅のチャンネルのボリュームは約10μLです。追加のサンプルボリュームは、チャネル内に存在するバッファを完全に交換し、サンプル希釈を回避するために推奨されます。
4. サンプルを読み込んだ後、すぐにRecordボタンをクリックしてデータ収集を開始し、100 s ビデオを取得します (図 1D)。
5. データ収集の最後にファイル名を入力し 、[OK] をクリックしてデータ ファイルを保存します。
6. カバーリップを捨て、イソプロパノールで濡れた綿の光学綿棒で対物レンズから油を拭きます。
   注: プロトコルはここで一時停止することができます。

4. MP データの分析

1. MPデータ処理ソフトウェアを使用して収集したビデオファイルを処理し、着陸イベントを特定します。
   1. [ファイル/開く] メニュー オプションを使用して分析用のファイルを読み込み、[分析] をクリックします。
   2. [ 読み込み ]ボタンをクリックしてキャリブレーション機能をロードし、[ ファイル/名前を付けて保存 ]メニューオプションを使用して分析データを保存します。
2. ガウス関数を使用して分子質量分布を適合させて、サンプル中の各種の相対濃度を得る。この分析は、一般的な科学グラフ作成ソフトウェアを使用して実行できます ( 表を参照)。
   1. 「eventsFitted.csv」ファイルをソフトウェアにインポートし、 プロット/統計/ヒストグラム 機能を使用して、分子質量分布(.csvファイルの列M)をプロットします。
   2. ヒストグラムをダブルクリックして、[ プロットプロパティ] ウィンドウを開きます。自動ビン分割を無効にし、ビンサイズ 2.5 kDa を選択します。[ 適用 ] ボタンと [移動 ] ボタンをクリックして、 ビン センター とカウント データ を作成します 。
   3. [ビンの中心と数]列を選択し、[解析/ピーク]および[ベースライン/マルチピークフィット]メニュー機能を使用して、ガウス関数にヒストグラムをフィットします。分布プロットのピーク位置をダブルクリックして示し、[NLFitを開く]ボタンをクリックします。
   4. 「xc」ピークセンターの 固定 チェックボックスをチェックし、その値を遊離抗体および単一および二重抗原抗体複合体の予想される分子質量に設定します。幅パラメータの [共有 ]オプションをオンにします。[フィット]ボタン を クリックします。ガウス成分の適合ピーク高さの値は、サンプル¹¹における各種の相対的な濃度を表す。
      注: ビン サイズは、質量分布プロットの解像度を最適化するために調整できます。MP の精度制限は約 1 kDa であり、ビン サイズが小さいほど、追加の情報は明らかにされずに、ディストリビューションのノイズが増幅される場合があります。ビンサイズが非常に大きいと、質量分布の細かい詳細が隠されます。
3. 次の式を使用して、各種の濃度分率を計算します。
   
   ここで 、h_i および f_i値は 、サンプル中の遊離抗体と単一および二重結合抗体のピーク高さと濃度分率をそれぞれ表します。

5. 平衡定数値の計算

1. 適切な分析ソフトウェアを使用して、ステップ4.3で計算した相互作用種の濃度画分をEq.1および2と一緒に適合させます。ここでは、スプレッドシートプログラム¹⁴ を使用して平衡定数を計算する方法を示します(「 補足情報」を参照)。
   1. "Kd 計算.xlsx" ワークシートを開きます。このワークシートでは、黄色で強調表示された行 1 から 10 のセル値を変更して、平衡定数計算を実行できます。
   2. ナノモル単位の推定Kd値を、表のセルB1およびB2に入力します。これらの開始値は、フィッティング手順で最適化されます。推定 K _d値が不明な場合は、セル B1 および B2 のデフォルト値は変更しません。
   3. ナノモル単位の(c_Ab)トートと(c_Ag)トートの値をセルD2およびE2に入力します。ステップ 4.3 で計算した分数の値をセル F2、G2、および H2 に入力します。異なる濃度比で複数のサンプルを測定した場合、それらのサンプルについて得られた追加の濃度値を2〜10行に入力することができる。
   4. データ/ソルバーメニュー機能を選択します。[目標の設定] ボックスに「$B $15」、"$B $1:$B$2" を 「可変セルの変更による方法:」ボックスに入力します。[最小] オプションの [最小] オプションを選択します。[非拘束変数を非負にする]チェックボックスをオンにし、ソルバ法としてGRG 非線形を選択します。[解決]ボタンをクリックします。最適な適合 K_d1およびK_d2値は、セル B1 と B2 に表示され、セル B15 の誤差の最終的な合計が表示されます。
      注:ソルバー機能がアクティブでない場合は、スプレッドシート プログラムの[ファイル] メニューの [オプション]を選択します。[アドイン] カテゴリで、[非アクティブなアプリケーションアドイン] の下にあるソルバーアドインを選択し、[Go]ボタンをクリックします。[ソルバー アドイン] チェック ボックスをオンにし、[OK]をクリックします。

図1:マスフォトメトリー画像(A) きれいなカバースリップに集められたイメージングバッファの代表的なネイティブビュー画像と、表面欠陥のあるカバースリップ上の(B)(C) イメージングバッファの微分比比画像と(D) AHT·HT ソリューション。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:MPフローチャンバの準備とローディング。(A)クリーニング手順のためのカバースリップ保持位置。(B)アルミニウム箔の表面に24 x 24 mmカバースリップ(中間層)と両面テープ(上層)の位置合わせ(下層、図示せず)。青い破線は、カット線の位置を示します。(C)2つのサンプルチャネルと組み立てられた流れチャンバの上部および側面図、および組み立てられた流れチャンバの画像。(D) 以前にバッファで満たされたフローチャネルへのサンプルロードの手順。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

結果

我々は、MPベースアッセイ¹¹を用いてヒトα-トロンビン(HT)とマウスモノクローナル抗ヒトトロンビン抗体(AHT)の相互作用を以前に調べた。HTの分子質量(37kDa)は40kDa検出限界以下であるため、最大サンプル濃度は、質量分布の分解能に悪影響を及ぼすことなく、50nMの濃度制限を超えることができます。実験は、AHT抗体を固定25nM濃度で、HT濃度は7.5nM、15nM、30nM、60nM、120nMの滴定?...

ディスカッション

ここで概説するマスフォトメトリーベースのプロトコルは、抗原抗体結合親和性を迅速かつ正確に測定する方法を提供します。MP分析では、非常に少量の材料を使用し、同じデータから、ストイチオメトリー、オリゴマー化、純度などの追加情報を評価できます(図5)。改質なしの場合、この方法は約5nM~500nMの範囲での解離定数の測定、および約20kDa以上の分子質量を有す...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
AcquireMP	Refeyn		MP data collection software
Anti-human thrombin	Haematologic Technologies	AHT-5020	RRID: AB_2864302
Cotton-tipped applicators	Thorlabs	CTA10	cotton optical swabs for lens cleaning
Coverslips 24x24 mm	Globe Scientific	1405-10
Coverslips 24x50 mm	Fisher Scientific	12-544-EP
DiscoverMP	Refeyn		MP data processing software
Forceps	Electron Microscopy Sciences	78080-CF	soft-tipped forceps for coverslips handling
Human α-thrombin	Haematologic Technologies	HCT-0020
Immersion oil	Thorlabs	MOIL-30
Isopropanol	Alfa Aesar	36644
Microsoft Excel	Microsoft		spreadsheet
OneMP	Refeyn		Mass Photometry instrument
Origin	OriginLab		scientific graphing software
PBS	Corning	46-013-CM	10x stock
Syringe filter	Millipore	SLGSR33SS	buffer and sample filtering