Rapida determinazione dell'affinità anticorpo-antigene mediante fotometria di massa

Riepilogo

Descriviamo un approccio a singola molecola alle misurazioni dell'affinità antigene-anticorpo usando la fotometria di massa (MP). Il protocollo basato su MP è veloce, accurato, utilizza una quantità molto piccola di materiale e non richiede modifiche proteiche.

Abstract

Le misurazioni della specificità e dell'affinità delle interazioni antigene-anticorpo sono di fondamentale importanza per le applicazioni mediche e di ricerca. In questo protocollo, descriviamo l'implementazione di una nuova tecnica a singola molecola, la fotometria di massa (MP), per questo scopo. MP è una tecnica senza etichetta e immobilizzazione che rileva e quantifica masse molecolari e popolazioni di anticorpi e complessi antigene-anticorpi a livello di singola molecola. MP analizza il campione antigene-anticorpo in pochi minuti, consentendo la determinazione precisa dell'affinità di legame e fornendo contemporaneamente informazioni sulla stechiometria e sullo stato oligomerico delle proteine. Questa è una tecnica semplice e diretta che richiede solo quantità di picomole di proteine e non costosi materiali di consumo. La stessa procedura può essere utilizzata per studiare il legame proteina-proteina per proteine con una massa molecolare superiore a 50 kDa. Per le interazioni proteiche multivalenti, le affinità di più siti di legame possono essere ottenute in un'unica misurazione. Tuttavia, il modo di misurazione a singola molecola e la mancanza di etichettatura impongono alcune limitazioni sperimentali. Questo metodo fornisce i migliori risultati se applicato alle misurazioni di affinità di interazione sub-micromolare, antigeni con una massa molecolare di 20 kDa o più grandi, e campioni proteici relativamente puri. Descriviamo anche la procedura per eseguire le fasi di adattamento e calcolo richieste utilizzando il software di analisi dei dati di base.

Introduzione

Gli anticorpi sono diventati strumenti onnipresenti della biologia molecolare e sono ampiamente utilizzati sia in applicazioni mediche che di ricerca. In medicina, sono di fondamentale importanza nella diagnostica, ma anche le loro applicazioni terapeutiche si stanno espandendo e nuove terapie basate su anticorpi vengono costantemente^{sviluppate 1,2,3,4}. Le applicazioni scientifiche degli anticorpi includono molte tecniche di laboratorio indispensabili come l'immunofluorescenza^5,l'immunoprecipitazione^6,la citometria a^{flusso 7,}ELISA e l'blotting occidentale. Per ognuna di queste applicazioni, ottenere misurazioni accurate delle proprietà di legame dell'anticorpo, inclusa l'affinità di legame e la specificità, è di fondamentale importanza.

Da quando il primo strumento commerciale di risonanza plasmonica di superficie (SPR) è stato introdotto nel 1990, i biosensori ottici sono diventati il "gold standard" della caratterizzazione degli anticorpi, ma altre tecniche, tra cui ELISA, sono anche abitualmente utilizzate per misurare le affinità^{anticorpali 8,9}. Questi metodi di solito richiedono l'immobilizzazione o l'etichettatura delle molecole analizzate, che possono potenzialmente influenzare l'interazione di interesse. Sono anche relativamente lenti, coinvolgendo più fasi di dosaggio prima che i risultati possano essere raccolti per l'analisi dei dati. Un metodo a singola molecola recentemente sviluppato, la fotometria di massa (MP), rileva le molecole direttamente in soluzione quando atterrano sulla superficie del microscopio coverslip^10,11. Il rilevamento ottico basato sulla diffusione della luce che MP utilizza non richiede l'etichettatura o la modifica delle proteine. Le singole molecole proteiche sono registrate dal microscopio a dispersione interferometrica come macchie scure che appaiono nell'immagine (Figura 1D), e diverse migliaia di molecole possono essere rilevate durante l'acquisizione di dati di un minuto¹². Il segnale generato da ogni singola particella viene quantificato e viene calcolato il suo valore di contrasto (oscurità relativa). I valori di contrasto interferometrico sono proporzionali alle masse molecolari delle proteine, il che consente l'identificazione di specie legate e libere nella miscela antigene-anticorpo. Allo stesso tempo, contando gli eventi di atterraggio molecolare, MP misura direttamente le popolazioni di specie. Ciò offre ai metodi basati su MP una capacità unica di quantificare in modo indipendente le affinità di più siti di associazione.

Il legame delle molecole diantigene( Ag ) ai due siti di legame dell'anticorpo intatto (Ab) può essere descritto come:

con le costanti di associazione di equilibrio K_a1 e K_a2 definite come:

dove c_i e f_i rappresentano rispettivamente la concentrazione e la frazione del componente i. La concentrazione totale di antigeni (c_Ag)_può essere espressa come:

Poiché le concentrazioni totali_{dell'anticorpo} (c_Ab) tot e dell'antigene (c_Ag)_tot sono note, questa equazione può essere utilizzata per adattarsi direttamente alle frazioni di componenti sperimentali ottenute dalle misurazioni MP e calcolare le costanti di associazione di equilibrio K_a1 e K_a2 (vedi Informazioni supplementari).

I dati MP possono anche essere utilizzati per stimare la cooperatività tra i due siti di legame anticorpale¹¹. Per due paratopi anticorpali con identiche costanti di legame microscopico, i fattori statistici che descrivono il processo di popolazione dell'Ab· Ag e Ab· I_{complessi ag 2} impongono che le costanti apparenti di equilibrio macroscopico K_a1 e K_a2 non siano numericamente uguali, e K_a1 = 4K_a2. Pertanto, i valori sperimentali di K_a1 < 4K_a2 indicano una cooperatività positiva tra i due siti di legame anticorpale. Allo stesso modo, K_a1 > 4K_a2 indica una cooperatività negativa.

Le misurazioni MP dell'affinità legante antigene-anticorpo sono veloci e richiedono una piccola quantità di materiale. Le distribuzioni di massa MP utilizzate per i calcoli costanti di equilibrio forniscono informazioni aggiuntive sulle proprietà del campione e consentono la valutazione della purezza del campione, dell'oligomerizzazione e dell'aggregazione in un singolo esperimento. Lo stesso metodo può essere usato per misurare il legame proteina-proteina ad alta affinità, e mp è particolarmente utile per studi sulle interazioni proteiche multivalenti. I complessi multi-proteina di solito hanno grandi masse molecolari, ottimali per il rilevamento mp, e i dati a singola molecola possono essere usati per misurare la stechiometria e calcolare contemporaneamente affinità di più siti di legame. Queste informazioni sono in genere difficili da ottenere utilizzando metodi basati sulla massa.

Senza modifiche, l'attuale protocollo è adatto per misurazioni di interazioni sub-micromolare ad affinità relativamente elevata con antigeni di massa molecolare di 20 kDa o superiore. Per risultati ottimali, gli stock proteici dovrebbero essere di elevata purezza, ma non ci sono requisiti tampone specifici. Utilizzando MP, il legame antigene-anticorpo può essere valutato in meno di cinque minuti. La raccolta e l'analisi dei dati necessarie per calcoli K_d accurati possono essere eseguite entro 30 minuti.

Protocollo

1. Preparare le camere di flusso

1. Pulire le coperture in vetro
   1. Utilizzando bottiglie di lavaggio con acqua distillata, etanolo e isopropanolo, sciacquare i copricapo da 24 mm x 50 mm nel seguente ordine: acqua, etanolo, acqua, isopropanolo, acqua. Asciugare i copricapo con un flusso di azoto pulito. È importante risciacquare i coprispalla dall'alto verso il basso, tenendo l'angolo inferiore con forcep a punta morbida. Asciugare il coperchio nella stessa direzione per evitare di trasferire la contaminazione dalle forcep (Figura 2A).
   2. Allo stesso modo, sciacquare le coperture da 24 mm x 24 mm con acqua distillata, etanolo e acqua distillata. Asciugare i copricapo con un flusso di azoto pulito.
   3. Identificare il lato di lavoro del coverslip, posizionare una goccia di acqua distillata sulla superficie del coverslip pulito e seguire i passaggi 3.1-3.2 del protocollo. Di solito solo un lato del coverslip da 24 mm x 50 mm ha la qualità ottica adatta per le misurazioni MP.
      NOTA: Dopo la messa a fuoco, non devono essere rilevabili imperfezioni superficiali significative e il valore del "segnale" mostrato nel software di raccolta dati deve essere inferiore allo 0,05% (Figura 1A-C). I lati di lavoro di tutti i copripaspaglia nella scatola sono orientati nella stessa direzione. La stessa procedura dovrebbe essere utilizzata per testare l'efficienza della pulizia delle labbra di copra.
2. Assemblare la camera di flusso
   1. Posizionare il coverslip da 24 mm x 24 mm su un pezzo di foglio di alluminio. Posizionare strisce di nastro a doppia mano sopra il coverslip da 24 mm x 24 mm, come illustrato nella figura 2B, e tagliare il nastro lungo il bordo del vetro. Separare il coverslip dal foglio di alluminio e attaccarlo al lato di lavoro del coverslip da 24 mm x 50 mm (Figura 2C).
      NOTA: le dimensioni del canale possono variare, ma si consiglia una larghezza di 3 mm-5 mm. I canali più ampi richiedono volumi di campioni più grandi e canali molto stretti possono essere difficili da caricare. Di solito, due canali paralleli possono essere facilmente creati sul coverslip da 24 mm x 24 mm. Il protocollo può essere messo in pausa qui.

2. Preparare i campioni anticorpo-antigene per le misurazioni di affinità

1. Filtrare almeno 2 ml del tampone PBS utilizzando filtri a siringa da 0,22 μm per rimuovere particelle di polvere o aggregati. Centrifugare il patrimonio proteico per 10 minuti alla velocità massima della centrifuga da tavolo (circa 16.000 x g).
   NOTA: PBS è il buffer consigliato per questo protocollo, ma MP non ha particolari requisiti tampone e anche altri tamponi biologici sono accettabili. Tuttavia, elevate concentrazioni di glicerolo (>10%) e i punti di forza ionici molto bassi (concentrazione di sale <10 mM) possono influire sulla qualità dell'immagine e dei dati e non sono raccomandati.
2. Determinare le concentrazioni effettive delle scorte di anticorpi e antigeni misurando la loro assorbanza UV di 280 nm.
3. Calcolare le concentrazioni di misura della miscela antigene-anticorpo. Se il valore stimato dell'affinità di legame anticorpale non è noto, pianificare la preparazione di un campione con un antigene da 30 nM e una concentrazione di anticorpi da 20 nM. Quando l'affinità approssimativa è nota, il rapporto anticorpo/antigene e le loro concentrazioni devono essere ottimizzati in base ai valori K_d previsti. Utilizzare la concentrazione totale di antigene nella miscela uguale alla somma del K d previsto_{e la} concentrazione totale di anticorpi nell'equazione seguente. Supponendo K_d1 = K_d2 per i due paratopi dell'anticorpo, ciò si tradurrà in concentrazioni comparabili dell'anticorpo libero e dei complessi anticorpo-antigene nel campione.
   
   Regolare la concentrazione di anticorpi per mantenere la concentrazione totale di proteine nel campione entro l'intervallo 10 nM e 50 nM. I migliori risultati si ottengono utilizzando miscele con concentrazioni di anticorpi tra 5 nM e 25 nM.
   NOTA: MP rileva proteine con una massa molecolare superiore a 40 kDa. Di conseguenza, le concentrazioni campione di antigeni con una massa molecolare inferiore a 40 kDa possono superare il tipico limite di 50 nM. Tuttavia, a concentrazioni superiori a circa 100 nM, anche gli antigeni a bassa massa molecolare potrebbero influenzare la qualità dell'immagine e l'accuratezza della determinazione K_d.
4. Preparare 50 μL della miscela anticorpo-antigene alla concentrazione di misura finale calcolata nella fase 2.3.
   NOTA: Per la determinazione K_d è necessario un solo campione della miscela antigene-anticorpo. Tuttavia, la preparazione di diversi campioni con diversi rapporti tra antigene e anticorpo può aiutare a ottimizzare la concentrazione del campione. Se vengono raccolti dati provenienti da più campioni, possono essere analizzati tramite un adattamento globale.
5. Incubare le miscele antigene-anticorpo per circa 10 minuti a temperatura ambiente per consentire alla reazione legante di raggiungere l'equilibrio chimico. Evitare tempi di incubazione inutilmente lunghi.
   NOTA: Il tempo di incubazione può variare a seconda della cinetica legante. Per confermare che l'equilibrio chimico è stato raggiunto, le misurazioni del campione possono essere ripetute in diversi tempi di incubazione. I valori K d invarianti_nel tempo indicano un'incubazione sufficientemente lunga. L'incubazione prolungata può portare a un significativo adsorbimento proteico sulla superficie dei gres plastici e, di conseguenza, a errori significativi nella determinazione della concentrazione proteica. Per questo motivo, il labware a bassa adesione è fortemente raccomandato per la preparazione del campione MP¹³.

3. Raccogliere i dati della fotometria di massa

1. Applicare una goccia di olio ad immersione al microscopio sull'obiettivo dello strumento MP e posizionare la camera di flusso assemblata sullo stadio del microscopio. Assicurarsi che l'olio si estende sul divario tra il coverslip e l'obiettivo.
2. Caricare la camera di flusso e mettere a fuoco il fotometro di massa.
   1. Depositare 10 μL di una soluzione tampone pulita e filtrata ad un'estremità del canale della camera di flusso preparata nel passaggio 1. Il liquido entrerà nel canale per azione capillare.
   2. Regolare la posizione Z dello stadio per mettere a fuoco il microscopio sulla superficie di lavoro del coverslip da 24 x 50 mm.
      1. Nella scheda Controllo messa a fuoco del software di raccolta dati, usate i pulsanti movimento dello stadio grossolano su e giù per apportare le regolazioni iniziali.
      2. Fate clic sul pulsante Nitidezza (Sharpness) per visualizzare la lettura del segnale di nitidezza e utilizzate i pulsanti di regolazione fine su e giù per massimizzare il valore nitidezza.
      3. Fare clic sui pulsanti Imposta messa a fuoco e Blocca messa a fuoco per attivare la funzione di rilevamento dello stato attivo. Un'immagine correttamentefocalizzata ( Figura 1A,C) deve avere il valore del "segnale" inferiore allo 0,05%.
         NOTA: Se il valore del "segnale" nella posizione massima di nitidezza è superiore allo 0,05%, ciò può indicare impurità sulla superficie del vetro o nel tampone.
3. Utilizzando lo stesso canale, caricare 20 μL del campione anticorpo-antigene depositarlo su un lato del canale e soffiare il liquido dall'altra estremità con un piccolo pezzo di carta assorbente (Figura 2D).
   NOTA: Il volume di un canale largo 3-5 mm è di circa 10 μL. Si consiglia il volume aggiuntivo del campione per sostituire completamente il buffer presente nel canale ed evitare la diluizione del campione.
4. Dopo aver caricato l'esempio, fare immediatamente clic sul pulsante Registra per avviare la raccolta dei dati, acquisendo un video di 100 s ( Figura1D).
5. Al termine della raccolta dati immettere il nome del file e fare clic su OK per salvare il file di dati.
6. Scartare le coverlips e pulire l'olio dalla lente obiettivo con tamponi ottici di cotone bagnati con isopropanolo.
   NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui.

4. Analizzare i dati MP

1. Elaborare il file video raccolto utilizzando il software di elaborazione dati MP per identificare gli eventi di destinazione.
   1. Utilizzare l'opzione di menu File/Apri per caricare il file per l'analisi e fare clic su Analizza.
   2. Fare clic sul pulsante Carica per caricare la funzione di calibrazione e salvare i dati analizzati utilizzando l'opzione di menu File/Salva risultati con nome.
2. Adatta la distribuzione di massa molecolare con funzioni gaussiane per ottenere concentrazioni relative di ogni specie nel campione. Questa analisi può essere eseguita utilizzando un software di grafica scientifica comune (vedere Tabella dei materiali).
   1. Importare il file "eventsFitted.csv" nel software e tracciare la distribuzione di massa molecolare (colonna M nel file .csv) utilizzando la funzione Plot/Statistics/Histogram.
   2. Fate doppio clic sull'istogramma per aprire la finestra Proprietà plottaggio (Plot Properties). Disattivare l'binning automatico e selezionare una dimensione della collocazione di 2,5 kDa. Fare clic sui pulsanti Applica e Vai per creare i dati Centri collocazione e Conteggi.
   3. Selezionate le colonne Bin Center e Counts e utilizzate la funzione di menu Analisi/Picchi e Base/Adattamento picco multiplo per adattare l'istogramma alle funzioni gaussiane. Fare doppio clic per indicare le posizioni di picco approssimative nel tracciato di distribuzione, quindi fare clic sul pulsante Apri NLFit.
   4. Controllare le caselle di controllo Fisse per i centri di picco "xc" e impostare i loro valori sulle masse molecolari previste dell'anticorpo libero e dei complessi antigene-anticorpi singoli e doppi. Selezionare l'opzione Condividi per i parametri di larghezza. Fare clic sul pulsante Adatta. I valori di altezza di picco montati dei componenti gaussiani rappresentano la concentrazione relativa di ciascuna specie nel campione^11.
      NOTA: le dimensioni del contenitore possono essere regolate per ottimizzare la risoluzione del grafico di distribuzione di massa. Il limite di precisione MP è di circa 1 kDa e le dimensioni più piccole del contenitore potrebbero amplificare il rumore della distribuzione, senza rivelare alcuna informazione aggiuntiva. Le dimensioni molto grandi dei bidoni oscureranno i dettagli fini delle distribuzioni di massa.
3. Calcolare la frazione di concentrazione di ciascuna specie utilizzando la seguente equazione:
   
   dove i valori h_i e f_i rappresentano rispettivamente le altezze di picco e le frazioni di concentrazione dell'anticorpo libero e l'anticorpo a singolo e doppio rilegato nel campione.

5. Calcolare i valori costanti di equilibrio

1. Adattare le frazioni di concentrazione delle specie di interazione calcolate nel passaggio 4.3 con Eq. 1 e 2 utilizzando un software analitico adatto. Qui viene illustrato un metodo per calcolare le costanti di equilibrio utilizzando un programma foglio di^{calcolo 14} (vedere Informazioni supplementari).
   1. Aprire il foglio di lavoro "Calcolo Kd.xlsx". In questo foglio di lavoro, i valori delle celle nelle righe da 1 a 10 evidenziati in giallo possono essere modificati per eseguire i calcoli delle costanti di equilibrio.
   2. Immettere i valori K_d stimati nelle unità nanomolari nelle celle B1 e B2 nella tabella. Questi valori di partenza verranno ottimizzati nella procedura di raccordo. Se i valori K_{d stimati} non sono noti, lasciare invariati i valori predefiniti nelle celle B1 e B2.
   3. Immettere i valori di (c_Ab)_tot e (c_Ag)_tot in unità nanomolari nelle celle D2 ed E2. Immettere i valori di frazione calcolati nel passaggio 4.3 nelle celle F2, G2 e H2. Se sono stati misurati più campioni con rapporti di concentrazione diversi, i valori di concentrazione supplementari ottenuti per tali campioni possono essere inseriti nelle righe da 2 a 10.
   4. Selezionare la funzione di menu Dati/Risolutore. Immettete "$B$15" nella casella "Imposta obiettivo" e "$B$1:$B$2" nella casella "Cambiando celle variabili:". Selezionare il pulsante di opzione Min per l'opzione A: . Selezionare la casella di controllo Rendi non negative le variabili non vincolate e selezionare GRG Nonlinear come metodo di risoluzione. Fare clic sul pulsante Risolvi. I valori K_{d1 e} K_{d2 più adatti} verranno visualizzati nelle celle B1 e B2 e nella somma finale degli errori al quadrato nella cella B15.
      NOTA: se la funzione Risolutore non è attiva, selezionare Opzioni dal menu File nel programma del foglio di calcolo. Nella categoria Componenti aggiuntivi selezionare il componente aggiuntivo Risolutore sotto i componenti aggiuntivi applicazioni inattivi e fare clic sul pulsante Vai. Selezionare la casella di controllo Componente aggiuntivo Risolutore e fare clic su OK.

Figura 1: Immagini fotometriche di massa. (A) Immagine rappresentativa della vista nativa del tampone di imaging raccolto su un coverslip pulito e (B) su una coverlip con imperfezioni superficiali. (C) Immagine differenziale ratiometrica del buffer di imaging e (D) dell'AHT· Soluzione HT. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Preparazione e caricamento della camera di flusso MP. (A) Copre la posizione di tenuta delle labbra per la procedura di pulizia. (B) Allineamento del coverslip da 24 x 24 mm (strato intermedio) e del nastro a doppia fronte (strato superiore) sulla superficie della lamina di alluminio (strato inferiore, non mostrato). Le linee tratteggiate blu mostrano la posizione delle linee di taglio. (C) Vista superiore e laterale della camera di flusso assemblata con due canali campione e un'immagine della camera di flusso assemblata. (D) Procedura per il caricamento del campione in un canale di flusso precedentemente riempito con buffer. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Risultati

Abbiamo precedentemente esaminato l'interazione tra l'anticorpo umano α-trombina (HT) e l'anticorpo monoclonale anti-umano della trombina (AHT) utilizzando il saggio basato su MP¹¹. Poiché la massa molecolare dell'HT (37 kDa) è inferiore al limite di rilevamento di 40 kDa, la concentrazione massima del campione può superare la limitazione di concentrazione di 50 nM MP senza influire negativamente sulla risoluzione delle distribuzioni di massa. L'esperimento è stato pianificato come serie di t...

Discussione

Il protocollo basato sulla fotometria di massa qui delineato fornisce un metodo rapido e accurato per misurare le affinità di legame antigene-anticorpo. L'analisi MP utilizza una quantità molto piccola di materiale e ulteriori informazioni, tra cui stechiometria, oligomerizzazione e purezza, possono essere valutate dagli stessi dati (Figura 5). Senza modifiche, questo metodo è applicabile alle misurazioni delle costanti di dissociazione nell'intervallo da 5 nM a 500 nM circa, e per le mol...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
AcquireMP	Refeyn		MP data collection software
Anti-human thrombin	Haematologic Technologies	AHT-5020	RRID: AB_2864302
Cotton-tipped applicators	Thorlabs	CTA10	cotton optical swabs for lens cleaning
Coverslips 24x24 mm	Globe Scientific	1405-10
Coverslips 24x50 mm	Fisher Scientific	12-544-EP
DiscoverMP	Refeyn		MP data processing software
Forceps	Electron Microscopy Sciences	78080-CF	soft-tipped forceps for coverslips handling
Human α-thrombin	Haematologic Technologies	HCT-0020
Immersion oil	Thorlabs	MOIL-30
Isopropanol	Alfa Aesar	36644
Microsoft Excel	Microsoft		spreadsheet
OneMP	Refeyn		Mass Photometry instrument
Origin	OriginLab		scientific graphing software
PBS	Corning	46-013-CM	10x stock
Syringe filter	Millipore	SLGSR33SS	buffer and sample filtering