Rapida determinazione dell'affinità anticorpo-antigene mediante fotometria di massa

Riepilogo

Descriviamo un approccio a singola molecola alle misurazioni dell'affinità antigene-anticorpo usando la fotometria di massa (MP). Il protocollo basato su MP è veloce, accurato, utilizza una quantità molto piccola di materiale e non richiede modifiche proteiche.

Abstract

Le misurazioni della specificità e dell'affinità delle interazioni antigene-anticorpo sono di fondamentale importanza per le applicazioni mediche e di ricerca. In questo protocollo, descriviamo l'implementazione di una nuova tecnica a singola molecola, la fotometria di massa (MP), per questo scopo. MP è una tecnica senza etichetta e immobilizzazione che rileva e quantifica masse molecolari e popolazioni di anticorpi e complessi antigene-anticorpi a livello di singola molecola. MP analizza il campione antigene-anticorpo in pochi minuti, consentendo la determinazione precisa dell'affinità di legame e fornendo contemporaneamente informazioni sulla stechiometria e sullo stato oligomerico delle proteine. Questa è una tecnica semplice e diretta che richiede solo quantità di picomole di proteine e non costosi materiali di consumo. La stessa procedura può essere utilizzata per studiare il legame proteina-proteina per proteine con una massa molecolare superiore a 50 kDa. Per le interazioni proteiche multivalenti, le affinità di più siti di legame possono essere ottenute in un'unica misurazione. Tuttavia, il modo di misurazione a singola molecola e la mancanza di etichettatura impongono alcune limitazioni sperimentali. Questo metodo fornisce i migliori risultati se applicato alle misurazioni di affinità di interazione sub-micromolare, antigeni con una massa molecolare di 20 kDa o più grandi, e campioni proteici relativamente puri. Descriviamo anche la procedura per eseguire le fasi di adattamento e calcolo richieste utilizzando il software di analisi dei dati di base.

Introduzione

Gli anticorpi sono diventati strumenti onnipresenti della biologia molecolare e sono ampiamente utilizzati sia in applicazioni mediche che di ricerca. In medicina, sono di fondamentale importanza nella diagnostica, ma anche le loro applicazioni terapeutiche si stanno espandendo e nuove terapie basate su anticorpi vengono costantemente^{sviluppate 1,2,3,4}. Le applicazioni scientifiche degli anticorpi includono molte tecniche di laboratorio indispensabili come l'immunofluorescenza^5,l'immunoprecipitazione^....

Protocollo

1. Preparare le camere di flusso

1. Pulire le coperture in vetro
   1. Utilizzando bottiglie di lavaggio con acqua distillata, etanolo e isopropanolo, sciacquare i copricapo da 24 mm x 50 mm nel seguente ordine: acqua, etanolo, acqua, isopropanolo, acqua. Asciugare i copricapo con un flusso di azoto pulito. È importante risciacquare i coprispalla dall'alto verso il basso, tenendo l'angolo inferiore con forcep a punta morbida. Asciugare il coperchio nella stessa direzione per evitare di trasferire la contaminazione dalle forcep (Figura 2A).
   2. Allo stesso modo, sciacquare le coperture da 24 mm x 24 mm con acqua distillata,....

Risultati

Abbiamo precedentemente esaminato l'interazione tra l'anticorpo umano α-trombina (HT) e l'anticorpo monoclonale anti-umano della trombina (AHT) utilizzando il saggio basato su MP¹¹. Poiché la massa molecolare dell'HT (37 kDa) è inferiore al limite di rilevamento di 40 kDa, la concentrazione massima del campione può superare la limitazione di concentrazione di 50 nM MP senza influire negativamente sulla risoluzione delle distribuzioni di massa. L'esperimento è stato pianificato come serie di t.......

Discussione

Il protocollo basato sulla fotometria di massa qui delineato fornisce un metodo rapido e accurato per misurare le affinità di legame antigene-anticorpo. L'analisi MP utilizza una quantità molto piccola di materiale e ulteriori informazioni, tra cui stechiometria, oligomerizzazione e purezza, possono essere valutate dagli stessi dati (Figura 5). Senza modifiche, questo metodo è applicabile alle misurazioni delle costanti di dissociazione nell'intervallo da 5 nM a 500 nM circa, e per le mol.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
AcquireMP	Refeyn		MP data collection software
Anti-human thrombin	Haematologic Technologies	AHT-5020	RRID: AB_2864302
Cotton-tipped applicators	Thorlabs	CTA10	cotton optical swabs for lens cleaning
Coverslips 24x24 mm	Globe Scientific	1405-10
Coverslips 24x50 mm	Fisher Scientific	12-544-EP
DiscoverMP	Refeyn		MP data processing software
Forceps	Electron Microscopy Sciences	78080-CF	soft-tipped forceps for coverslips handling
Human α-thrombin	Haematologic Technologies	HCT-0020
Immersion oil	Thorlabs	MOIL-30
Isopropanol	Alfa Aesar	36644
Microsoft Excel	Microsoft		spreadsheet
OneMP	Refeyn		Mass Photometry instrument
Origin	OriginLab		scientific graphing software
PBS	Corning	46-013-CM	10x stock
Syringe filter	Millipore	SLGSR33SS	buffer and sample filtering