Schnelle Bestimmung der Antikörper-Antigen-Affinität durch Massenphotometrie

Zusammenfassung

Wir beschreiben einen einmolekularen Ansatz für Antigen-Antikörper-Affinitätsmessungen mit Massenphotometrie (MP). Das MP-basierte Protokoll ist schnell, genau, verwendet eine sehr geringe Menge an Material und erfordert keine Proteinmodifikation.

Zusammenfassung

Messungen der Spezifität und Affinität von Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen sind für medizinische und forschungsmedizinische Anwendungen von entscheidender Bedeutung. In diesem Protokoll beschreiben wir die Implementierung einer neuen Einzelmolekültechnik, der Massenphotometrie (MP), zu diesem Zweck. MP ist eine etiketten- und immobilisierungsfreie Technik, die molekulare Massen und Populationen von Antikörpern und Antigen-Antikörper-Komplexen auf einer Einmolekülebene erkennt und quantifiziert. MP analysiert die Antigen-Antikörper-Probe innerhalb von Minuten, um die Bindungsaffinität präzise zu bestimmen und gleichzeitig Informationen über die Stoichiometrie und den oligomeren Zustand der Proteine bereitzustellen. Dies ist eine einfache und einfache Technik, die nur Picomol-Mengen an Protein und keine teuren Verbrauchsmaterialien erfordert. Das gleiche Verfahren kann verwendet werden, um die Protein-Protein-Bindung für Proteine mit einer Molekularmasse von mehr als 50 kDa zu untersuchen. Bei multivalenten Proteinwechselwirkungen können die Affinitäten mehrerer Bindungsstellen in einer einzigen Messung ermittelt werden. Die einmolekulare Messart und die fehlende Etikettierung setzen jedoch einige experimentelle Einschränkungen mit sich. Diese Methode liefert die besten Ergebnisse, wenn sie auf Messungen von submikromolaren Wechselwirkungsaffinitäten, Antigenen mit einer Molekularmasse von 20 kDa oder größer und relativ reinen Proteinproben angewendet wird. Wir beschreiben auch das Verfahren zur Durchführung der erforderlichen Anpassungs- und Berechnungsschritte mit einer Basisdatenanalysesoftware.

Einleitung

Antikörper sind zu allgegenwärtigen Werkzeugen der Molekularbiologie geworden und werden sowohl in medizinischen als auch in Forschungsanwendungen ausgiebig eingesetzt. In der Medizin sind sie in der Diagnostik von entscheidender Bedeutung, aber auch ihre therapeutischen Anwendungen werden erweitert und neue Antikörper-basierte Therapien werden ständig entwickelt^1,2,3,4. Die wissenschaftlichen Anwendungen von Antikörpern umfassen viele unverzichtbare Labortechniken wie Immunfluoreszenz⁵, Immunpräzipitation⁶, Durchflusszytometrie⁷, ELISA und Western Blotting. Für jede dieser Anwendungen ist es von entscheidender Bedeutung, genaue Messungen der Bindungseigenschaften des Antikörpers, einschließlich Bindungsaffinität und Spezifität, zu erhalten.

Seit der Einführung des ersten kommerziellen Oberflächen-Plasmonresonanz-Instruments (SPR) im Jahr 1990 sind optische Biosensoren zum "Goldstandard" der Antikörpercharakterisierung geworden, aber auch andere Techniken, einschließlich ELISA, werden routinemäßig zur Messung von Antikörperaffinitäten^8,9verwendet. Diese Methoden erfordern in der Regel eine Immobilisierung oder Kennzeichnung der analysierten Moleküle, was die Interaktion von Interesse potenziell beeinflussen kann. Sie sind auch relativ langsam und beinhalten mehrere Assay-Schritte, bevor die Ergebnisse für die Datenanalyse gesammelt werden können. Eine kürzlich entwickelte Einzelmolekülmethode, die Massenphotometrie (MP), erkennt Moleküle direkt in Lösung, wenn sie auf der Oberfläche des Mikroskopdeckels^{landen 10,11}. Die lichtstreuende optische Detektion, die MP verwendet, erfordert keine Proteinkennzeichnung oder -modifikation. Einzelne Proteinmoleküle werden vom interferometrischen Streumikroskop als dunkle Flecken im Bild aufgezeichnet (Abbildung 1D), und mehrere tausend Moleküle können während der einminütigen Datenerfassung¹²nachgewiesen werden. Das von jedem einzelnen Teilchen erzeugte Signal wird quantifiziert, und sein Kontrastwert (relative Dunkelheit) wird berechnet. Die interferometrischen Kontrastwerte sind proportional zu den Molekularmassen der Proteine, was die Identifizierung gebundener und freier Arten in der Antigen-Antikörper-Mischung ermöglicht. Gleichzeitig misst MP durch zählende molekulare Landeereignisse direkt die Artenpopulationen. Dies gibt MP-basierten Methoden eine einzigartige Fähigkeit, Affinitäten mehrerer Bindungssites unabhängig zu quantifizieren.

Die Bindung der Antigenmoleküle (Ag) an die beiden Bindungsstellen des intakten Antikörpers (Ab) kann wie folgt beschrieben werden:

mit den Gleichgewichtsassoziationskonstanten K_a1 und K_a2 definiert als:

wobei c_i und f_i die Konzentration und den Anteil der Komponente idarstellen. Die Gesamtantigenkonzentration (c_Ag)_tot kann wie:

Da die Gesamtkonzentrationen des Antikörpers (c_Ab)_tot und antigen (c_Ag)_tot bekannt sind, kann diese Gleichung verwendet werden, um die experimentellen Bauteilfraktionen, die aus den MP-Messungen gewonnen wurden, direkt anzupassen und die Gleichgewichtsassoziationskonstanten K_a1 und K_a2 zu berechnen (siehe Ergänzende Informationen).

Die MP-Daten können auch verwendet werden, um die Kooperative zwischen den beiden Antikörperbindungsstellen¹¹zu schätzen. Bei zwei Antikörperparatopen mit identischen mikroskopischen Bindungskonstanten sind die statistischen Faktoren, die den Prozess der Population des Ab- Ag und Ab Ag_2-Komplexe diktieren, dass die scheinbaren makroskopischen Gleichgewichtskonstanten K_a1 und K_a2 nicht numerisch gleich sind und K_a1 = 4K_a2. Daher weisen die experimentellen Werte von K_a1 < 4K_a2 auf eine positive Kooperatoaktivität zwischen den beiden Antikörperbindungsstellen hin. Ebenso weist K_a1 > 4K_a2 auf negative Kooperatonität hin.

MP-Messungen der Antigen-Antikörper-Bindungsaffinität sind schnell und erfordern eine geringe Menge an Material. Die MP-Massenverteilungen, die für Gleichgewichtskonstantenberechnungen verwendet werden, liefern zusätzliche Informationen über die Probeneigenschaften und ermöglichen die Bewertung der Probenreinheit, Oligomerisierung und Aggregation in einem einzigen Experiment. Die gleiche Methode kann verwendet werden, um eine proteinreiche Protein-Protein-Bindung mit hoher Affinität zu messen, und MP ist besonders nützlich für Studien mit multivalenten Proteinwechselwirkungen. Multiproteinkomplexe haben in der Regel große molekulare Massen, optimal für die MP-Erkennung, und Einzelmoleküldaten können verwendet werden, um stoichiometrie zu messen und Affinitäten mehrerer Bindungsstellen gleichzeitig zu berechnen. Diese Informationen sind in der Regel schwierig, mit massenbasierten Methoden zu erhalten.

Ohne Modifikationen eignet sich das aktuelle Protokoll für Messungen von relativ hochaffinen submikromolaren Wechselwirkungen mit Antigenen einer Molekülmasse von 20 kDa oder größer. Für optimale Ergebnisse sollten Proteinvorräte von hoher Reinheit sein, aber es gibt keine spezifischen Pufferanforderungen. Durch die Verwendung von MP kann die Antigen-Antikörper-Bindung in weniger als fünf Minuten beurteilt werden. Die datenerfassung und -analyse, die für genaue K_{d-Berechnungen} erforderlich sind, kann innerhalb von 30 Minuten durchgeführt werden.

Protokoll

1. Bereiten Sie die Strömungskammern vor

1. Reinigen Sie die Glasabdeckungen
   1. Mit Waschflaschen mit destilliertem Wasser, Ethanol und Isopropanol die 24 mm x 50 mm Abdeckungen in folgender Reihenfolge abspülen: Wasser, Ethanol, Wasser, Isopropanol, Wasser. Trocknen Sie die Abdeckungen mit einem Strom von sauberem Stickstoff. Es ist wichtig, die Abdeckungen von oben nach unten zu spülen, die untere Ecke mit Soft-Tipp-Zange zu halten. Trocknen Sie den Deckelinrutsch in die gleiche Richtung, um eine Kontamination durch die Zange zu vermeiden (Abbildung 2A).
   2. Spülen Sie die 24 mm x 24 mm Abdeckungen mit destilliertem Wasser, Ethanol und destilliertem Wasser ab. Trocknen Sie die Abdeckungen mit einem Strom von sauberem Stickstoff.
   3. Identifizieren Sie die Arbeitsseite des Deckels, legen Sie einen Tropfen destilliertes Wasser auf die Oberfläche des sauberen Deckelschlupfes und folgen Sie den Schritten 3.1–3.2 des Protokolls. Normalerweise hat nur eine Seite des 24 mm x 50 mm Coverslipdie die optische Qualität, die für MP-Messungen geeignet ist.
      ANMERKUNG: Nach der Fokussierung sollten keine signifikanten Oberflächenunvollkommenheiten erkennbar sein, und der in der Datenerfassungssoftware angezeigte "Signal"-Wert sollte weniger als 0,05 % betragen (Abbildung 1A-C). Die Arbeitsseiten aller Abdeckungen im Karton sind in die gleiche Richtung ausgerichtet. Das gleiche Verfahren sollte verwendet werden, um die Effizienz der Abdeckungsrutschreinigung zu testen.
2. Montieren Sie die Strömungskammer
   1. Positionieren Sie den 24 mm x 24 mm Abdeckzettel auf einem Stück Aluminiumfolie. Legen Sie Streifen aus doppelseitigem Klebeband auf den 24 mm x 24 mm Coverslip, wie in Abbildung 2B dargestellt, und schneiden Sie das Band entlang der Glaskante. Trennen Sie den Deckelvon von der Aluminiumfolie und befestigen Sie ihn an der Arbeitsseite des 24 mm x 50 mm Abdeckzettels(Abbildung 2C).
      HINWEIS: Die Kanalgröße kann variieren, es wird jedoch eine Breite von 3 mm–5 mm empfohlen. Breitere Kanäle erfordern größere Sample-Volumes und sehr schmale Kanäle können schwierig zu laden sein. Normalerweise lassen sich auf dem 24 mm x 24 mm Abdecksch leicht zwei parallele Kanäle erstellen. Das Protokoll kann hier angehalten werden.

2. Bereiten Sie die Antikörper-Antigen-Proben für die Affinitätsmessungen vor

1. Filtern Sie mindestens 2 ml des PBS-Puffers mit 0,22 m Spritzenfiltern, um Staubpartikel oder Aggregate zu entfernen. Zentrifugieren Sie den Proteinbestand 10 Minuten lang mit der maximalen Geschwindigkeit der Tischzentrifuge (ca. 16.000 x g).
   HINWEIS: PBS ist der empfohlene Puffer für dieses Protokoll, aber MP hat keine besonderen Pufferanforderungen, und andere biologische Puffer sind ebenfalls akzeptabel. Hohe Glycerinkonzentrationen (>10%) und sehr geringe Ionenstärken (Salzkonzentration <10 mM) können das Bild und die Datenqualität beeinflussen und werden nicht empfohlen.
2. Bestimmen Sie die tatsächlichen Konzentrationen der Antikörper- und Antigenvorräte, indem Sie ihre UV-Absorption von 280 nm messen.
3. Berechnen Sie die Messkonzentrationen des Antigen-Antikörper-Gemischs. Wenn der geschätzte Wert der Antikörperbindungsaffinität nicht bekannt ist, planen Sie, eine Probe mit 30 nM Antigen und 20 nM Antikörperkonzentration vorzubereiten. Wenn die ungefähre Affinität bekannt ist, sollten das Antikörper-Antigen-Verhältnis und ihre Konzentrationen entsprechend den erwarteten K_d-Werten optimiert werden. Verwenden Sie die Gesamtantigenkonzentration in der Mischung in Höhe der Summe des erwarteten K_d und die Gesamtantikörperkonzentration in der folgenden Gleichung. Unter der Annahme von K_d1 = K_d2 für die beiden Paratope des Antikörpers führt dies zu vergleichbaren Konzentrationen des freien Antikörpers und der Antikörper-Antigen-Komplexe in der Probe.
   
   Passen Sie die Antikörperkonzentration an, um die Gesamtproteinkonzentration in der Probe im Bereich von 10 nM und 50 nM zu halten. Die besten Ergebnisse werden mit Mischungen mit Antikörperkonzentrationen zwischen 5 nM und 25 nM erzielt.
   HINWEIS: MP erkennt Proteine mit einer Molekularmasse von mehr als 40 kDa. Folglich können Probenkonzentrationen von Antigenen mit einer Molekularmasse von weniger als 40 kDa den typischen Grenzwert von 50 nM überschreiten. Bei Konzentrationen von mehr als 100 nM können jedoch auch niedrigmolekulare Antigene die Bildqualität und Genauigkeit der K_d-Bestimmung beeinflussen.
4. Bereiten Sie 50 l des Antikörper-Antigen-Gemischs in seiner endgültigen Messkonzentration in Schritt 2.3 vor.
   HINWEIS: Für die K_d-Bestimmung wird nur eine Probe des Antigen-Antikörper-Gemischs benötigt. Die Vorbereitung mehrerer Proben mit unterschiedlichen Antigen-Antikörper-Verhältnissen kann jedoch dazu beitragen, die Probenkonzentration zu optimieren. Wenn Daten aus mehreren Proben gesammelt werden, können sie über eine globale Passform analysiert werden.
5. Inkubieren Sie das Antigen-Antikörper-Gemisch(n) ca. 10 min bei Raumtemperatur, damit die Bindungsreaktion ein chemisches Gleichgewicht erreicht. Vermeiden Sie unnötig lange Inkubationszeiten.
   HINWEIS: Die Inkubationszeit kann je nach Bindungskinetik variieren. Um zu bestätigen, dass das chemische Gleichgewicht erreicht wurde, können Probenmessungen zu unterschiedlichen Inkubationszeiten wiederholt werden. Zeitinvariante K_d-Werte zeigen eine ausreichend lange Inkubation an. Eine längere Inkubation kann zu einer signifikanten Proteinadsorption an der Oberfläche der Kunststoff-Laborware und damit zu signifikanten Fehlern bei der Bestimmung der Proteinkonzentration führen. Aus diesem Grund wird Laborware mit geringer Haftung für die MP-Probenvorbereitung^{empfohlen 13}.

3. Sammeln Sie die Massenphotometrie-Daten

1. Tragen Sie einen Tropfen Mikroskop-Tauchöl auf das MP-Instrumentenobjektiv auf und legen Sie die montierte Durchflusskammer auf die Mikroskopbühne. Stellen Sie sicher, dass das Öl die Lücke zwischen dem Deckelund dem Ziel überspannt.
2. Laden Sie die Durchflusskammer und fokussieren Sie das Massenphotometer.
   1. Legen Sie 10 l einer sauberen, gefilterten Pufferlösung an einem Ende des in Schritt 1 vorbereiteten Durchflusskammerkanals ab. Flüssigkeit gelangt durch Kapillarwirkung in den Kanal.
   2. Passen Sie die Z-Position der Bühne an, um das Mikroskop auf die Arbeitsfläche des 24 x 50 mm-Coverslips zu fokussieren.
      1. Verwenden Sie auf der Registerkarte Fokussteuerung der Datenerfassungssoftware die Tasten Up und Down, um die ersten Anpassungen vorzunehmen.
      2. Klicken Sie auf die Schaltfläche Schärfe, um die Schärfesignalanzeige anzuzeigen, und verwenden Sie die Schaltflächen für die Einstellung nach oben und unten, um den Schärfewert zu maximieren.
      3. Klicken Sie auf die Schaltflächen Fokus festlegen und Fokus sperren, um die Fokusverfolgungsfunktion zu aktivieren. Ein richtig fokussiertes Bild (Abbildung 1A,C) sollte den "Signal"-Wert unter 0,05% haben.
         HINWEIS: Wenn der "Signal"-Wert bei maximaler Schärfeposition über 0,05 % liegt, kann dies auf Verunreinigungen auf der Glasoberfläche oder im Puffer hinweisen.
3. Laden Sie mit dem gleichen Kanal 20 l der Antikörper-Antigen-Probe, indem Sie sie auf einer Seite des Kanals ablagern und die Flüssigkeit vom anderen Ende mit einem kleinen Stück Blotting-Papier btun (Abbildung 2D).
   ANMERKUNG: Das Volumen eines 3–5 mm breiten Kanals beträgt ca. 10 l. Es wird empfohlen, das zusätzliche Probenvolumen vollständig zu ersetzen und eine Probenverdünnung zu vermeiden.
4. Nachdem Sie das Beispiel geladen haben, klicken Sie sofort auf die Schaltfläche Aufzeichnen, um die Datensammlung zu starten, und erfassen Sie ein 100 s Video (Abbildung 1D).
5. Geben Sie am Ende der Datensammlung den Dateinamen ein, und klicken Sie auf OK, um die Datendatei zu speichern.
6. Entsorgen Sie die Abdeckungen und wischen Sie das Öl von der Objektivlinse mit optischen Wattestäbchen mit Isopropanol.
   HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.

4. Analysieren Sie die MP-Daten

1. Verarbeiten Sie die gesammelte Videodatei mit der MP-Datenverarbeitungssoftware, um die Landeereignisse zu identifizieren.
   1. Verwenden Sie die Menüoption Datei/Öffnen, um die Datei für die Analyse zu laden, und klicken Sie auf Analysieren.
   2. Klicken Sie auf die Schaltfläche Laden, um die Kalibrierungsfunktion zu laden und die analysierten Daten mit der Menüoption Datei/Ergebnisse speichern als zu speichern.
2. Passen Sie die molekulare Massenverteilung mit Gaußschen Funktionen an, um relative Konzentrationen jeder Art in der Probe zu erhalten. Diese Analyse kann mit einer gemeinsamen wissenschaftlichen Graphiksoftware durchgeführt werden (siehe Tabelle der Materialien).
   1. Importieren Sie die Datei "eventsFitted.csv" in die Software und zeichnen Sie die molekulare Massenverteilung (Spalte M in der .csv Datei) mit der Funktion Plot/Statistik/Histogramm.
   2. Doppelklicken Sie auf das Histogramm, um das Fenster PlotEigenschaften zu öffnen. Deaktivieren Sie das automatische Binning und wählen Sie eine Behältergröße von 2,5 kDa aus. Klicken Sie auf die Schaltflächen Anwenden und Gehen, um die Bin-Center- und Counts-Daten zu erstellen.
   3. Wählen Sie die Spalten Bin-Zentren und -Zählungen aus, und verwenden Sie die Menüfunktion Analysis/Peaks und Baseline/Multiple Peak Fit, um das Histogramm mit Gaußschen Funktionen anzupassen. Doppelklicken Sie, um die ungefähren Spitzenpositionen im Verteilungsdiagramm anzugeben, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche NLFit öffnen.
   4. Überprüfen Sie die Kontrollkästchen Für die "xc"-Spitzenzentren und legen Sie deren Werte auf die erwarteten Molekularmassen des freien Antikörpers und der Einzel- und Doppelantigen-Antikörperkomplexe fest. Aktivieren Sie die Option Freigeben für die Breitenparameter. Klicken Sie auf die Schaltfläche Anpassen. Die angepassten Spitzenhöhenwerte der Gaußschen Komponenten stellen die relative Konzentration jeder Art in der Stichprobe¹¹dar.
      HINWEIS: Die Lagerplatzgröße kann angepasst werden, um die Auflösung des Massenverteilungsdiagramms zu optimieren. Die MP-Präzisionsgrenze beträgt ca. 1 kDa, und kleinere Behältergrößen können das Rauschen der Verteilung verstärken, ohne zusätzliche Informationen zu offenbaren. Sehr große Behältergrößen werden die feinen Details der Massenverteilungen verschleiern.
3. Berechnen Sie den Konzentrationsanteil jeder Art mit der folgenden Gleichung:
   
   wobei die werte h_i und f_i Spitzenhöhen und Konzentrationsfraktionen des freien Antikörpers bzw. des ein- bzw. doppelgebundenen Antikörpers in der Probe darstellen.

5. Berechnen sie Gleichgewichtskonstantenwerte

1. Passen Sie die in Schritt 4.3 berechneten Konzentrationsfraktionen der Wechselwirkungsarten mit Eq. 1 und 2 mit einer geeigneten Analysesoftware an. Hier zeigen wir eine Methode zur Berechnung von Gleichgewichtskonstanten mit einem Tabellenkalkulationsprogramm¹⁴ (siehe Ergänzende Informationen).
   1. Öffnen Sie das Arbeitsblatt "Kd-Berechnung.xlsx". In diesem Arbeitsblatt können die in gelb hervorgehobenen Zellenwerte in den Zeilen 1 bis 10 geändert werden, um die Berechnung der Gleichgewichtskonstanten durchzuführen.
   2. Geben Sie die geschätzten K_d-Werte in nanomolaren Einheiten in die Zellen B1 und B2 in die Tabelle ein. Diese Startwerte werden im Fitting-Verfahren optimiert. Wenn die geschätzten K_d-Werte nicht bekannt sind, lassen Sie die Standardwerte in den Zellen B1 und B2 unverändert.
   3. Geben Sie die Werte von (c_Ab)_tot und (c_Ag)_tot in nanomolaren Einheiten in die Zellen D2 und E2 ein. Geben Sie die in Schritt 4.3 berechneten Bruchwerte in die Zellen F2, G2 und H2 ein. Wurden mehrere Proben mit unterschiedlichen Konzentrationsverhältnissen gemessen, so können zusätzliche Konzentrationswerte, die für diese Proben ermittelt wurden, in die Zeilen 2 bis 10 eingegeben werden.
   4. Wählen Sie die Menüfunktion Daten/Solver aus. Geben Sie "$B 15" in das Feld "Ziel festlegen" und "$B-1:$B-2" in das Feld "Durch Ändern von variablen Zellen:" ein. Wählen Sie das Min-Optionsfeld für die Option An: aus. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Nicht eingeschränkte Variablen nicht negativ machen, und aktivieren Sie GRG Nonlinear als Lösungsmethode. Klicken Sie auf die Schaltfläche Lösen. Die am besten passenden K_d1- und_K-d2-Werte werden in Zelle B1 und B2 und die endgültige Summe der quadrierten Fehler in Zelle B15 angezeigt.
      HINWEIS: Wenn die Solver-Funktion nicht aktiv ist, wählen Sie optionen im Menü Datei im Tabellenkalkulationsprogramm aus. Wählen Sie in der Kategorie Add-Ins das Solver-Add-In unter den Inaktiven Anwendungs-Add-Ins aus, und klicken Sie auf die Schaltfläche Gehen. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Solver-Add-In, und klicken Sie auf OK.

Abbildung 1: Massenphotometriebilder. (A) Repräsentatives natives Ansichtsbild des Bildgebungspuffers, der auf einem sauberen Abdeckzettel und (B) auf einem Deckschzettel mit Oberflächenunvollkommenheiten gesammelt wurde. (C) Differentialratiometrisches Bild des Bildgebungspuffers und (D) des AHT HT-Lösung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: MP-Durchflusskammervorbereitung und -beladung. (A) Coverslip Halteposition für den Reinigungsvorgang. (B) Ausrichtung des 24 x 24 mm Abdeckzettels (mittlere Schicht) und des doppelseitigen Bandes (obere Schicht) auf der Oberfläche der Aluminiumfolie (untere Schicht, nicht abgebildet). Blaue gestrichelte Linien zeigen die Position der Schnittlinien an. (C) Obere und seitliche Ansicht der montierten Durchflusskammer mit zwei Probenkanälen und einem Bild der montierten Durchflusskammer. (D) Verfahren zum Laden von Proben in einen zuvor mit Puffer gefüllten Durchflusskanal. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergebnisse

Wir haben zuvor die Wechselwirkung von humanen α-Thrombin (HT) und Maus monoklonalen anti-humanen Thrombin-Antikörper (AHT) mit dem MP-basierten Assay¹¹untersucht. Da die Molekularmasse des HT (37 kDa) unter der 40 kDa-Nachweisgrenze liegt, kann die maximale Probenkonzentration die Konzentrationsbeschränkung von 50 nM MP überschreiten, ohne die Auflösung von Massenverteilungen negativ zu beeinflussen. Das Experiment war als Titrationsserie mit dem AHT-Antikörper mit einer festen Konzentratio...

Diskussion

Das hier beschriebene Mass Photometry-basierte Protokoll bietet eine schnelle und genaue Methode zur Messung von Antigen-Antikörper-Bindungsaffinitäten. Die MP-Analyse verwendet eine sehr geringe Menge an Material, und zusätzliche Informationen – einschließlich Stoichiometrie, Oligomerisierung und Reinheit – können anhand derselben Daten ausgewertet werden (Abbildung 5). Ohne Modifikationen ist diese Methode auf die Messungen von Dissoziationskonstanten im Bereich von ca. 5 nM bis 5...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
AcquireMP	Refeyn		MP data collection software
Anti-human thrombin	Haematologic Technologies	AHT-5020	RRID: AB_2864302
Cotton-tipped applicators	Thorlabs	CTA10	cotton optical swabs for lens cleaning
Coverslips 24x24 mm	Globe Scientific	1405-10
Coverslips 24x50 mm	Fisher Scientific	12-544-EP
DiscoverMP	Refeyn		MP data processing software
Forceps	Electron Microscopy Sciences	78080-CF	soft-tipped forceps for coverslips handling
Human α-thrombin	Haematologic Technologies	HCT-0020
Immersion oil	Thorlabs	MOIL-30
Isopropanol	Alfa Aesar	36644
Microsoft Excel	Microsoft		spreadsheet
OneMP	Refeyn		Mass Photometry instrument
Origin	OriginLab		scientific graphing software
PBS	Corning	46-013-CM	10x stock
Syringe filter	Millipore	SLGSR33SS	buffer and sample filtering