自動画像解析を用いたげっ歯類モデルのサブスタチングニグラにおけるドーパミン作動性ニューロン密度の半定量的決定

要約

ここでは、ラットの実質的なニグラ・パルス・コンパクでのドーパミン作動性ニューロン数の半定量的決定のための自動化された方法を提示する。

要約

立体ニグラにおけるドーパミン作動性ニューロンの数の推定は、前臨床パーキンソン病研究における重要な方法である。現在、公平な立体的なカウントは、これらの細胞の定量化のための標準ですが、それは、すべてのプロジェクトのために実現可能ではないかもしれない、面倒で時間のかかるプロセスのままです。ここでは、あらかじめ定義された対象領域におけるラベル付き細胞の量を正確に推定できる画像解析プラットフォームの使用について説明する。我々は、ラット脳におけるこの分析方法のステップバイステップのプロトコルを説明し、実質的なニグラにおける変異型αシヌクレインの発現によるチロシンヒドロキシラーゼ陽性ニューロンの有意な減少を同定できることを実証する。我々は、この方法論を、公平なステレロジーによって得られた結果と比較することによって検証した。この方法を組み合わせると、ドーパミン作動性ニューロン数の変化を検出するための時間効率と正確なプロセスを提供し、したがって、細胞生存に対する介入の効果を効率的に決定するのに適している。

概要

パーキンソン病(PD)は、α-シヌクレイン(α-syn)を含むタンパク質凝集体の存在と、実質的なニグラパルス・パルス・スプカ(SNpc)におけるドーパミン作動性ニューロンの優等喪失を特徴とする一般的な神経変性運動障害である。ドーパミン作動性ニューロン数の定量化は、結合トリアティアル系の完全性の評価を可能にするため、PD研究の重要な部分であり、したがって、潜在的な疾患修飾療法の有効性を評価する重要なエンドポイントを提供する。現在、細胞数の定量化基準は、組織の2次元(2D)断面を利用して、3次元(3D)構造における容積物特徴を^2、3、4に推定する非バイアス的な立体数計数である。現代の設計ベースのステレオロジー手法は、包括的なランダムサンプリング手順を採用し、潜在的なアーティファクトと系統的エラーを回避するためにカウントプロトコル(プローブと呼ばれる)を適用し、動物間変動⁵よりもわずかに大きい差の信頼性の高い検出を可能にする。ステテロロジーは生体組織学的研究のための強力な分析ツールを提供するが、それは時間のかかる、均一な標本の準備を前提とし、臨床前の翻訳調査にますます必要とされる効率に影響を与えることができるいくつかのステップで検証を必要とします。

デジタル科学の最近の技術進歩により、非偏型ステレロジーの代理としての必要性を満たしながら、実体顕微鏡なしで病理学のより効率的な評価のための新しいアプリケーションを採用することが可能になりました。これらの方法は、速度を向上させ、人為的ミスを減らし、立体技術^6,7の再現性を向上^させる。HALOは、デジタル病理における定量的組織分析用の画像解析プラットフォームの1つです。それはさまざまなモジュールで構成され、パターン認識アルゴリズムを使用して組織のセクション全体の細胞ごとに形態学的および多重化された発現データを報告する。細胞核FLモジュールは、核または細胞質中の蛍光マーカーの免疫蛍光陽性を測定する。これにより、各マーカーの正のセル数と、各セルの強度スコアを報告できます。このモジュールは、個々の細胞サイズおよび強度測定を提供するように適合することができるが、この特徴はドーパミン作動性ニューロンの定量化に必要ではない。

本研究の目的は、ニグラル神経変性^8、9、10の以前に検証されたウイルスベクターベースのα-synラットモデルを用いてこの方法^を検証することである。このモデルでは、ヒト変異体A53T α-synは、アデノ関連ウイルスハイブリッド血清型1/2(AAV1/2)の立体的注射によりSNpcで発現し、6週間にわたって有意な神経変性をもたらす。逆側未注入SNpcは、いくつかの研究において、注入された側の内部統制として役立つかもしれない。より一般的には、動物のコントロールコホートにおけるAAV-空ベクトル(AAV-EV)の注入は、陰性対照として使用される。自動画像解析ソフトウェアを使用して、注入されたSNpcに残っているドーパミン作動性ニューロンの密度を6週間後に推定するためのステップバイステップガイドを提示する(図1)。

プロトコル

すべての手順は、大学医療ネットワーク動物ケア委員会によって承認され、動物ケアに関するカナダの評議会によって設定されたガイドラインと規制に従って行われました.

1. 定位注射

1. ペアハウスの成人女性スプレイグ・ドーリーラット(250-280 g)は、木製の寝具と食べ物と水へのアドリブアクセスを備えたケージに入っています。一定の温度と湿度で定期的に12時間の明暗サイクル(06:30のライト)で動物のコロニーを維持します。
2. 前^に説明した^8,10のように脳の右側のSNpcに直接AAVの一方的な定位注射を行う(各ラボの好みに応じて、右または左側)。3.4 x 10¹²ゲノム粒子/mLの最終用の引き込みで、AAV1/2の2 μLを注入します。

2. 脳切除・免疫検査(IHC)

1. 3分間麻酔室に入れることで、5%イソファランでラットを麻酔します。他の承認された方法は、適切な制度的レビューの後、このステップのために使用することができます.
2. ラットが深部麻酔の外科面に達したら、壊死表にしっかりと貼られた鼻コーンに移す。テープを使用してラットの前足を固定し、つま先のピンチ応答法を使用して麻酔の深さを決定します。続行する前に、動物が応答しない必要があります。
3. 胸骨の下に横切りを行い、胸膜腔を露出させるために、胸部ケージの全長に沿って横隔膜を切断します。胸骨を止め、頭の上に置きます。
4. 鉗子を使用して心臓をクランプし、左心室の後端に灌流ポンプに接続された蝶の針を挿入します。ラットを150mLのヘパリン化食ラインで経皮的に、または目と皮膚が透明になるまでパーフューズする。4%パラホルムアルデヒド(PFA)による灌流は、生理食動物の代わりに、ある種の抗体またはシンナー脳切血で免疫染色を容易にすることが好ましい。
5. 灌流が完了したら、ギロチンで切断し、脳を脳マトリックスに抽出し、腹側表面を上に向けます。
6. 新鮮なカミソリの刃を使用して、コロナ平面2 mmのロストラルを光学チアズムにカットします。スライスしながら脳をゆがめないように、ブレードを左右にスライドさせます。
7. 脳の後部を、4%PFAの約20mLを含む前ラベル付きバイアルに浸し、48時間の後固定を室温で行います。脳の前部は、−80°Cで保存する前に−42°Cに冷やした2−メチルブタンでフラッシュ冷凍されてもよい。
8. 48時間後、リン酸緩衝生理食塩液(PBS)に30%スクロースを含む標識されたバイアルに固定脳を移し、沈むまで4°Cで保存します(48-72時間)。
9. 試料ステージのトラフにドライアイスを入れ、その後100%エタノールを入れてミクロトームを準備します。ステージが冷却されたら、最適な切断温度(OCT)化合物をステージに絞り、直径2cm、厚さ0.5cmの円を形成します。部分的に凍結したら、慎重にOCTのマウンドに脳を下げ、線条体切断面がステージと平行に保たれます。
10. 脳が凍結するのを助けるためにステージに多くのドライアイスを追加します。脳がクリーム色になったら、ドライアイスの段階をクリアします。
11. 右半球と左半球を区別するために25G針で脳の右側に穴を開けます。目的の解剖学的構造を通して針を渡さないで注意してください。
12. ブレグマ-3.8から始まり、ブレグマ-6.8で終わるコロナ平面の40 μmのセクションを連続的に切断した。
13. 凍結防止液(40%PBS、30%2-エトキシエタノール、30%グリセロール)を用いたラベルチューブに6シリーズを保管してください。各シリーズは、12の脳のセクションを含む必要があります。
14. 免疫ヒストケミカル染色用のセクションを1セット選択し、0.2%PBS-Tで3 x 10分洗浄で凍結防止液を洗い流します。
15. ブロッキング溶液(10%正常ヤギ血清(NGS)、2%ウシ血清アルブミン(BSA)0.2%PBS-T)で穏やかな栄養を伴うRTで1時間ブロックする。ウサギ抗チロシンヒドロキシラーゼ(TH)抗体(1:500)およびマウス抗α-syn抗体(1:500)を室温で一晩0.2%PBS-Tで2%NGSでインキュベーションしてこれに従ってください。
16. 0.2%PBS-Tで3 x 5分洗浄で一次抗体を洗い流し、続いてヤギ抗ウサギアレクサフルオール488二次抗体(1:500)とヤギ抗マウスアレクサフルオール555二次抗体を2%NGSで0.2%PBS-Tで1時間インキュベーションします。セクションが光から保護され、優しく栄養を取り除かれるようにします。
17. 0.2%PBS-Tで3 x 5分洗浄で二次抗体を洗い流し、狭いペイントブラシを使用して光とほこりから保護されたスライドにセクションの完全なセットを取り付けます。蛍光実装媒体と透明な爪のニスとシールカバースリップ。

3. 共焦点顕微鏡と画像取得

1. 10倍の倍率でコンフォーカル顕微鏡に結合されたソフトウェアを使用してIHC画像をキャプチャします。ピンホールを1.5 AUに開き、合計1.5μmの広い平面をキャプチャし、脳の注入側に焦点を当てます。
2. [ 取得 ]タブで、[ タイルスキャン イメージング]オプションをオンにして、寸法を10 x 4に設定します。
3. 取得モードパネルで、ズームを 1.1 に設定します。これにより、タイル スキャン イメージ間の明白なステッチ マークを回避できます。
4. 高品質の画像取得を確実にするため、 フレーム サイズ を 1024 x 1024 ピクセルに設定し 、平均 を 2 に設定します。
5. チャンネルパネルでトラック1をAlexa488に、トラック2をAlexa555に設定します。
6. ステージにスライドをロードし、強いTH染色のセクションを選択します。[取得]パネルで[ライブ]をクリックします。
7. チャンネルパネルで、信号を最大化し、バックグラウンドからのノイズを制限するレベルにレーザー強度とゲインを設定します。範囲インジケータを使用して、信号が露出過多にならないようにします(濃い赤色のオーバーレイで示されます)。
8. 複数のスライドで上記の手順を繰り返して、スライド間のレーザー強度/ゲインを調整できないため、スライド間で一貫した染色を行います。
9. [ 取得 ] タブで、[ 職位] ボックスをオンにします。
10. この時点で、イメージングを開始する準備が整いました。接眼レンズを使用して、正のTH染色を示す最初のセクションを選択し、目的のポイント(すなわち、SNpc)に焦点を当て、その後、セクションの中線にステージを移動します。これにより、x、y、z 軸の位置が保存され、セクション全体をキャプチャするタイル スキャンがイメージ化されます。
11. SNpc 全体のすべてのセクションに対して上記の手順を繰り返し、SNpc の画像の完全なセットを提供します。未注入側の詳細な分析が必要な場合は、非注入側にフォーカスを設定してステップ3.10から3.11を繰り返す必要があります。

4. 画像解析と定量

1. 適切なソフトウェアを使用して画像ファイルを分離し、画像ファイルを自動画像解析ソフトウェアにインポートします。
2. ペン注釈ツールを選択して、SNpc の周囲に注釈を描画して、関心のある領域を定義します。
   注:ドーパミン作動性ニューロンの損失が多いセクションでは、一時的に放出/吸収を増加させることで、SNpcを明確に定義するのに役立ちます(図2)。
3. [分析] タブに移動し、ドロップダウンメニューから [リアルタイムチューニング] を選択します。これにより、セクションイメージに別のウィンドウが開き、解析パラメータをリアルタイムで変更できます(図3)。
4. [ 解析倍率 ]セクションで、適切な画像ズームを選択します。
5. [ 細胞検出 ]セクションで、TH染色に使用する色素として核色素を選択します(Alexa Fluor 488)。
6. リアルタイムチューニングウィンドウを注意深く見ながら、 核コントラストしきい値、 最小核強度、 核セグメンテーション攻撃性、 核サイズ の設定を調整します。
   注: 個々のセルを[リアルタイム チューニング]ウィンドウ内の 1 つのセルとして正確に表現することは、正確性にとって重要です。これらの設定は、使用するソフトウェアによって任意のスケールになりますが、ソフトウェアが個々のセルを正確に区別し、セルと背景を正確に区別するには、正しい調整が必要です(図3)。
7. このプロセスを少なくとも 10 個の別々のサンプルで繰り返し、異なるセクション間でセルを構成するものの一様な一致を確認します。
   注: 分析タブのマーカー 1 またはマーカー 2 セクションを使用して、同じ解析プラットフォーム内で(α-syn または NeuN など)セルマーカーを追加で識別できます。
8. 適切な数の画像をサンプリングし、リアルタイムチューニングを調整したら、[ 設定アクション] ドロップダウンメニューで分析設定を保存します。
9. 分析するすべての画像を選択し、[ 分析] をクリックします。
10. 保存した解析設定を選択し、[ 解析領域 ] ウィンドウで [アノテーション レイヤー] チェックボックスをオンにします。次に、 レイヤ 1 を チェックして、[ 解析] をクリックします。
    注:単一の脳の場合、分析は通常約5分かかります。完成した結果は、セルとしてカウントされた各項目を明確に示します (図 4)。
11. 完了したら、すべてのセクションのサマリー分析データをエクスポートします。 オブジェクト分析データをエクスポートするオプションがあり、検出された個々のセルのセルサイズを含む詳細なデータを提供します。このデータセットは、毒素/治療に応答して細胞サイズの変化を調べるために使用することができます。
12. 動物ごとに分析された各セクションの合計セルと、分析された領域の合計 (mm²⁾を追加します。分析したセルの総数を分析した領域の合計で割って、各ラットの SNpc 内のセル/mm² の数を計算します。

結果

上記の方法をAAV注射の6週間後に採取した脳組織に適用することにより、ラット脳のSNpcにおけるAAV発現変異体A53T α-syn(AAV-A53T)の立体的注射は、コントロールとしての空のベクターAAV(AAV-EV)の注入と比較してドーパミン作動性ニューロンの密度の有意な減少を生じることを実証した(図5A、B)。AAV-EVを注射したラットのSNpcにおけるTH陽性ニューロン^/mm2の?...

ディスカッション

PDの前臨床モデルにおけるドーパミン作動系の完全性の信頼性の高い評価は、潜在的な疾患修飾療法の有効性を決定するために重要である。したがって、組織病理学的データの信頼性と再現性を低下させる可能性のある交点を制御し、最小限に抑えることが重要です。慎重な定量的結果は、定性的または半定量的な記述だけではより多くの情報を提供することができます。同時に、時間と資?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
A-Syn Antibody	ThermoFisher Scientific	32-8100
ABC Elite	Vector Labs	PK-6102
Alexa Fluor 488 secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-11008
Alexa Fluor 555 secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-28180
Alkaline phosphatase-conjugated anti-rabbit igG	Jackson Immuno	111-055-144
Biotinylated anti-mouse IgG	Vector Labs	BA-9200
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153
DAKO fluorescent mouting medium	Agilent	S3023
HALO™	Indica Labs
Histo-Clear II	Diamed	HS202
ImmPACT DAB Peroxidase substrate	Vector Labs	SK-4105
LSM880 Confocal Microscope	Zeiss
NeuN Antibody	Millipore	MAB377
Normal Goat Serum	Vector Labs	S-1000-20
OCT	Tissue-Tek
Paraformaldehyde	BioShop	PAR070.1
Sliding microtome	Leica	SM2010 R
Stereo Investigator	MBF Bioscience
Sucrose	BioShop	SUC700
TH Antibody	ThermoFisher Scientific	P21962
VectaMount mounting medium	Vector Labs	H-5000
Vector Blue Alkaline Phosphatase substrate	Vector Labs	SK-5300
Zen Black Software	Zeiss
Zen Blue Software	Zeiss