자동 이미지 분석을 사용하여 설치류 모델의 실질적인 Nigra에서 도파민성 뉴런 밀도의 반정량 측정

요약

여기서 우리는 쥐 실질니그라 파스 콤팩트카에서 도파민성 뉴런 수의 반정적 측정을 위한 자동화된 방법을 제시한다.

초록

nigra의 도파민성 뉴런의 수를 추정하는 것은 임상 전 파킨슨 병 연구의 핵심 방법입니다. 현재, 편견 입체 계수는 이러한 세포의 정량화를위한 표준이지만, 모든 프로젝트에 대해 가능하지 않을 수 있습니다 힘들고 시간이 많이 소요되는 과정남아있다. 여기서는 미리 정의된 관심 영역에서 표지된 셀의 양을 정확하게 추정할 수 있는 이미지 분석 플랫폼의 사용을 설명합니다. 우리는 쥐 두뇌에 있는 분석의 이 방법에 대한 단계별 프로토콜을 설명하고 지하 니그라에서 돌연변이 α-synuclein의 발현때문에 티로신 하이드록실라제 양성 뉴런의 현저한 감소를 확인할 수 있음을 보여줍니다. 우리는 편견없는 입체학에 의해 얻은 결과와 비교하여이 방법론을 검증했습니다. 종합하면, 이 방법은 도파민성 뉴런 수의 변화를 검출하기 위한 시간 효율적이고 정확한 프로세스를 제공하므로 세포 생존에 대한 내정간섭의 효과를 효율적으로 판단하는 데 적합합니다.

서문

파킨슨병(PD)은 α-시뉴클레인(α-syn)을 함유한 단백질 골재의 존재와 실산니그라 파스 콤카(SNpc)^1에서도파민성 뉴런의 우대손실을 특징으로 하는 만연한 신경퇴행성 운동 장애이다. 도파민성 뉴런 수의 정량화는 PD 연구의 중요한 부분으로, 이는 nigrostriatal 시스템의 무결성의 평가를 허용하므로, 잠재적인 질병 수정 치료제의 효과를 평가하는 중요한 종점을 제공한다. 현재, 세포 수의 정량화에 대한 표준은 조직의 2차원(2D) 단면을 활용하여 3차원(3D) 구조^2,3,4에서체적 특징을 추정하는 편견없는 입체 적 계수이다. 현대설계 기반 입체적 방법은 포괄적인 무작위 샘플링 절차를 채택하고 잠재적인 아티팩트및 체계적인 오류를 피하기 위해 계수 프로토콜(프로브라고 함)을 적용하여 동물 간 변형^5보다약간 더 큰 차이를 안정적으로 감지할 수 있도록 합니다. 입체학은 생체 내 조직학 연구를 위한 강력한 분석 도구를 제공하지만, 시간 집약적이며 균일한 표본 준비를 가정하며, 임상 전 번역 조사에 점점 더 필요한 효율성에 영향을 미칠 수 있는 여러 단계에서 검증이 필요합니다.

디지털 과학의 최근 기술 발전은 입체 현미경없이 병리학의 보다 효율적인 평가를위한 새로운 응용 프로그램을 채택 할 수 있게, 편견 입체학의 대리로 필요성을 채우는 동안. 이러한 방법은 속도를 높이고, 사람의 실수를 줄이며, 입체 기술의 재현성을 향상^6,7. HALO는 디지털 병리학에서 정량적 조직 분석을 위한 이러한 이미지 분석 플랫폼 중 하나입니다. 패턴 인식 알고리즘을 사용하여 전체 조직 섹션에 걸쳐 세포별 기초에 대한 다양한 다양한 모듈 및 보고서 형태학적 및 멀티플렉스 식 데이터를 포함한다. 세포핵 FL 모듈은 핵 또는 세포질에서 형광 마커의 면역 형광 성 양성을 측정합니다. 이를 통해 각 마커에 대해 양성 셀 수와 각 셀에 대한 강도 점수를 보고할 수 있습니다. 이 기능은 도파민성 뉴런의 정량화에는 필요하지 않지만 모듈은 개별 세포 크기와 강도 측정을 제공하도록 조정할 수 있습니다.

이 연구의 목적은 이전에 검증된 바이러스 벡터 기반 α-syn 쥐 모델인 nigral neurodegeneration^8,9,10을사용하여 이 방법을 확인하는 것이다. 본 모델에서, 인간 돌연변이 A53T α-syn은 아데노 관련 바이러스 하이브리드 혈청형 1/2(AAV1/2)의 스테레오테테 주사에 의해 SNpc에서 발현되어 6주 동안 상당한 신경 변성을 초래한다. 반대로 주입되지 않은 SNpc는 일부 연구에서 주입 된 측에 대한 내부 제어 역할을 할 수 있습니다. 더 일반적으로, 동물의 대조군에서 AAV-빈 벡터(AAV-EV)를 주입하는 것은 음의 대조군으로 사용된다. 자동 이미지 분석소프트웨어(도 1)를이용하여 6주 후 주입된 SNpc에 남아 있는 도파민성 뉴런의 밀도를 추정하는 단계별 가이드를 제시한다.

프로토콜

모든 절차는 대학 건강 네트워크 동물 관리위원회에 의해 승인되고 동물 관리에 캐나다 위원회에 의해 설정 된 지침과 규정에 따라 수행되었다.

1. 스테레오전술 주입

1. 나무 침구와 음식과 물에 대한 광고 리브 액세스 케이지에 쌍 하우스 성인 여성 스프라그 - Dawley 쥐 (250-280 g). 일정한 온도와 습도가 있는 일반 12h 빛/암흑 주기(06:30의 조명)에서 동물 서식지를 유지합니다.
2. 이전에 설명된 바와 같이 뇌의 오른쪽에 있는 SNpc(오른쪽 또는 왼쪽, 각 실험실의 선호도에 따라)에 AAV를 직접 일방적으로 스테레오전술 주사를^{수행한다.} 3.4 x 10¹² 게놈 입자/mL의 최종 티터에 AAV1/2의 2 μL을 주입하십시오.

2. 뇌 단면 및 면역 작용화학 (IHC)

1. 3 분 동안 마취 챔버에 배치하여 5 %의 이소플루란으로 쥐를 마취. 다른 승인된 방법은 적절한 제도적 검토 후 이 단계에 사용될 수 있다.
2. 쥐가 깊은 마취의 수술 비행기에 도달하면, 단단히 부검 테이블에 부착 코 콘으로 전송합니다. 테이프를 사용하여 쥐의 앞발을 확보하고 발가락 핀치 응답 방법을 사용하여 마취의 깊이를 결정합니다. 동물은 계속하기 전에 응답하지 않아야합니다.
3. 흉골 아래 측면 절개를 하고 흉막 의 전체 길이를 따라 다이어프램을 잘라 흉막 구멍을 노출합니다. 머리 위에 있는 헤스테트로 흉골을 들어 올리고 고정합니다.
4. 집게를 사용하여 심장을 고정하고 좌심실의 후면 끝에 관류 펌프에 연결된 나비 바늘을 삽입합니다. 150mL의 헤파린화식 식염수또는 눈과 피부가 맑을 때까지 쥐를 분리합니다. 4% 파라포름알데히드(PFA)를 가진 관류는 식염수 대신, 특정 항체 또는 얇은 뇌 절면을 통해 면역염색을 용이하게 하는 것이 바람직할 수 있다.
5. 일단 관류가 완료되면, 기요틴으로 참수하고 뇌 매트릭스에 뇌를 추출, 복부 표면을 향하고.
6. 신선한 면도날을 사용하여 관상 비행기에서 2mm 로스트랄을 광학 치아솜으로 자릅니다. 슬라이스하는 동안 뇌가 뒤틀리는 것을 피하기 위해 블레이드를 좌우로 밀어 내십시오.
7. 실온에서 48h의 후고에 대한 4% PFA의 약 20mL를 포함하는 사전 표지된 유리병에 뇌의 후방 부분을 침수하십시오. 뇌의 전방 부분은 -80°C에서 저장하기 전에 -42°C로 냉각된 2-메틸부탄에서 얼어 붙일 수 있다.
8. 48h 후, 고정 된 뇌를 인산염 완충 식염수 (PBS)에서 30 % 자당을 포함하는 표지 된 유리병에 옮기고 4 ° C에서 가라 앉을 때까지 저장합니다 (48-72 h).
9. 시편 단계의 트로프에 드라이 아이스를 배치하고 100% 에탄올을 넣음으로써 마이크로토메를 준비합니다. 스테이지가 냉각되면 직경 2cm, 두께 0.5cm의 원을 형성할 때까지 최적의 절삭 온도(OCT) 화합물을 스테이지에 짜냅니다. 일단 부분적으로 동결되면, 조심스럽게 10 월의 마운드에 뇌를 낮추고, 줄무늬 절단 표면이 무대와 평행하게 유지되도록.
10. 뇌가 얼릴 수 있도록 무대에 드라이 아이스를 더 넣습니다. 뇌가 크림색으로 변하면 드라이 아이스의 무대를 치웁울 수 있습니다.
11. 오른쪽반구와 왼쪽 반구를 구별하기 위해 25G 바늘로 뇌의 오른쪽에 구멍을 찌른다. 관심있는 해부학 구조를 통해 바늘을 통과하지 않도록주의하십시오.
12. 브레그마 -3.8에서 시작하여 bregma -6.8에서 끝나는 관상 비행기의 40 μm 섹션을 연속적으로 절단합니다.
13. 동결 방지 용액(PBS 40%, 2-에톡시에탄올 30%, 글리세롤 30%)을 장착한 라벨이 부착된 튜브에 6시리즈를 저장합니다. 각 시리즈에는 12개의 뇌 섹션이 포함되어야 합니다.
14. 면역히스토케미칼 염색을 위한 섹션 1세트를 선택하고 0.2% PBS-T에서 3 x 10분 세척으로 동결 방지 용액을 씻어냅니다.
15. 블로킹 용액(일반 염소 세럼 10%, 소세럼 알부민(BSA)이 0.2% PBS-T로 부드러운 투두처리로 RT에서 1h를 차단합니다. 토끼 안티 티로신 하이드록실라제(TH) 항체(1:500) 및 마우스 항-α-syn 항체(1:500)를 실온에서 하룻밤 0.2% PBS-T로 배양하여 이에 따라보세요.
16. 0.2% PBS-T에서 3 x 5 분 세척으로 1 차 항체를 씻어 내고, 염소 안티 래빗 알렉사 플루어 488 이차 항체 (1:500)와 염소 항 마우스 알렉사 플루어 555 이차 항체를 0.2 % PBS-T로 씻어. 섹션이 빛과 견과류로부터 부드럽게 보호되는지 확인합니다.
17. 0.2% PBS-T로 3 x 5분 세척으로 이차 항체를 씻어내고 좁은 페인트 브러시를 사용하여 빛과 먼지로부터 보호되는 슬라이드에 전체 섹션 세트를 장착합니다. 투명 네일 바니시장착 매체와 씰이 있는 커버슬립.

3. 공초점 현미경 검사법과 이미지 수집

1. 10배 배율로 공초점 현미경에 결합된 소프트웨어를 사용하여 IHC 이미지를 캡처합니다. 핀홀을 1.5 AU로 열어 ~1.5 μm의 넓은 평면을 포착하고 뇌의 주입측에 초점을 맞춥니다.
2. 수집 탭에서 타일 스캔 이미징 옵션을 확인하고 치수를 10 x 4로 설정합니다.
3. 수집 모드 패널에서 확대/축소를 1.1로 설정합니다. 이렇게 하면 타일 스캔 이미지 사이에 명백한 스티치 표시가 없습니다.
4. 프레임 크기를 1024 x 1024 픽셀로 설정하고 평균을 2로 설정하여 고품질 의 이미지 수집을 보장합니다.
5. 채널 패널에서 트랙 1을 Alexa488로 설정하고 2트랙을 Alexa555로 추적합니다.
6. 슬라이드를 스테이지에 로드하고 TH 염색이 강한 단면을 선택합니다. 획득 패널에서 라이브를 클릭합니다.
7. 채널 패널에서 레이저 강도와 게인을 신호를 최대화하고 배경에서 노이즈를 제한하는 수준으로 설정합니다. 범위 표시기를 사용하여 신호가 과다 노출되지 않았는지 확인합니다(어두운 빨간색 오버레이로 표시됨).
8. 레이저 강도 /게인슬라이드 사이에 조정할 수 없기 때문에 슬라이드 사이에 염색이 일관되도록 여러 슬라이드로 위의 단계를 반복하십시오.
9. 획득 탭에서 위치 확인란을 선택합니다.
10. 이 시점에서 이미징을 시작할 준비가 되었습니다. 접안렌즈를 사용하여, 긍정적 인 TH 염색을 보여주는 첫 번째 섹션을 선택하고 관심 지점 (즉, SNpc)에 초점을 설정한 다음 스테이지를 섹션의 중간선으로 이동합니다. 이렇게 하면 x, y 및 z 축의 위치를 저장하고 전체 섹션을 캡처하는 타일 스캔을 이미지화합니다.
11. SNpc의 전체 이미지 집합을 제공하는 SNpc 전체의 모든 섹션에 대해 위의 단계를 반복합니다. 주입되지 않은 측의 상세한 분석이 필요한 경우, 단계 3.10 에서 3.11 단계는 주입되지 않은 측에 초점을 설정하여 반복되어야한다.

4. 이미지 분석 및 수량

1. 적절한 소프트웨어를 사용하여 이미지 파일을 분리하고 이미지 파일을 자동화된 이미지 분석 소프트웨어로 가져옵니다.
2. SNpc 주위에 음부작성을 그릴 펜 어음 도구를 선택하여 관심 영역을 정의합니다.
   참고: 다량의 도파민성 뉴런 손실이 있는 섹션에서, 일시적으로 발광/흡수를 증가시켜 SNpc(도2)를명확하게 정의하는 데 도움이 될 수 있다.
3. 분석 탭으로 이동하고 드롭다운 분석 메뉴에서 실시간 튜닝을 선택합니다. 이렇게 하면 섹션 이미지의 별도의 창이 열리므로 분석 매개 변수를 실시간으로 수정할 수있습니다(그림 3).
4. 분석 확대 섹션에서 적절한 이미지 확대/축소를 선택합니다.
5. 세포 검출 섹션에서, TH 염색에 사용되는 염료로 핵염을 선택한다(Alexa Fluor 488).
6. 실시간 튜닝 창을 주의 깊게 보면서 핵 대비 임계값, 최소 핵 강도, 핵 세분화 공격성및 핵 크기 설정을 조정합니다.
   참고: 실시간 튜닝 창에서 각 개별 셀을 단일 셀로 정확하게 표현하는 것은 정확성에 매우 중요합니다. 이러한 설정은 사용되는 소프트웨어에 따라 임의적인 척도에 있지만 소프트웨어가 개별 셀과 셀 과 배경 간에 정확하게 분화할 수 있도록 올바른 조정이필요합니다(그림 3).
7. 이 프로세스를 최소 10개의 개별 샘플로 반복하여 다른 섹션에 걸쳐 셀을 구성하는 것에 대한 균일한 동의를 보장합니다.
   참고: 추가 셀 마커(예: α-syn 또는 NeuN)는 분석 탭의 마커 1 또는 마커 2 섹션을 사용하여 동일한 분석 플랫폼 내에서 식별할 수 있습니다.
8. 적절한 수의 이미지를 샘플링하고 그에 따라 실시간 튜닝이 조정되면 설정 작업 드롭다운 메뉴에서 분석 설정을 저장합니다.
9. 분석할 모든 이미지를 선택하고 분석할 이미지를 클릭합니다.
10. 방금 저장한 분석 설정을 선택하고 분석 영역에서 는 별표 레이어 상자를 선택합니다. 그런 다음 레이어 1을 확인하고 분석을클릭합니다.
    참고: 단일 뇌의 경우 분석은 일반적으로 약 5분이 소요됩니다. 완료된 결과에셀로 계산된 각 항목(그림4)이명확하게 표시됩니다.
11. 완료되면 모든 섹션에 대한 요약 분석 데이터를 내보냅니다. 감지된각 셀의 셀 크기를 포함하여 자세한 데이터를 제공하는 개체 분석 데이터를 내보낼 수 있는 옵션이 있습니다. 이 데이터 집합은 독소/치료에 반응하여 세포 크기의 변화를 검사하는 데 사용될 수 있습니다.
12. 동물별로 분석된 각 섹션과 총 분석 영역(mm^2)의총 셀을 추가합니다. 각 쥐에 대한 SNpc의 셀/mm² 수를 계산하기 위해 분석된 총 영역으로 총 셀 수를 나눕니다.

결과

AAV 주사 후 6주 후에 수집된 뇌 조직에 위의 방법을 적용함으로써, 쥐 뇌의 SNpc에서 돌연변이 A53T α-syn(AAV-A53T)을 발현하는 AAV의 스테레오테테 주사는 빈 벡터 AAV(AAV-EV)의 주입에비해 도파미네릭 뉴런의 밀도가 현저한 감소임을 입증하였다(AAV-EV). AAV-EV로 주입된 쥐의 SNpc에서 TH 양성 뉴런/mm^2의 평균 수는 276.2 ± 34.7, AAV-A53T로 주입된 쥐의 SNpc에서 41.2 ± 17(P= ...

토론

PD의 전임상 모델에서 도파민 시스템의 무결성에 대한 신뢰할 수 있는 평가는 잠재적인 질병 수정 치료제의 효과를 결정하는 데 매우 중요합니다. 따라서 조직 병리학 데이터의 신뢰성과 재현성을 감소시킬 수 있는 잠재적인 혼동을 제어하고 최소화하는 것이 중요합니다. 신중한 정량적 결과는 정성적 또는 반정성 설명보다 더 많은 정보를 제공할 수 있습니다. 동시에, 우리는 시간과 자원의 제약...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
A-Syn Antibody	ThermoFisher Scientific	32-8100
ABC Elite	Vector Labs	PK-6102
Alexa Fluor 488 secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-11008
Alexa Fluor 555 secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-28180
Alkaline phosphatase-conjugated anti-rabbit igG	Jackson Immuno	111-055-144
Biotinylated anti-mouse IgG	Vector Labs	BA-9200
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153
DAKO fluorescent mouting medium	Agilent	S3023
HALO™	Indica Labs
Histo-Clear II	Diamed	HS202
ImmPACT DAB Peroxidase substrate	Vector Labs	SK-4105
LSM880 Confocal Microscope	Zeiss
NeuN Antibody	Millipore	MAB377
Normal Goat Serum	Vector Labs	S-1000-20
OCT	Tissue-Tek
Paraformaldehyde	BioShop	PAR070.1
Sliding microtome	Leica	SM2010 R
Stereo Investigator	MBF Bioscience
Sucrose	BioShop	SUC700
TH Antibody	ThermoFisher Scientific	P21962
VectaMount mounting medium	Vector Labs	H-5000
Vector Blue Alkaline Phosphatase substrate	Vector Labs	SK-5300
Zen Black Software	Zeiss
Zen Blue Software	Zeiss