Détermination semi-quantitative de la densité des neurones dopaminergiques dans la Substantia Nigra des modèles de rongeurs à l’aide de l’analyse automatisée d’images

Résumé

Ici nous présentons une méthode automatisée pour la détermination semi-quantitative du nombre dopaminergique de neurone dans le substantia nigra compacta de substantia de rat.

Résumé

L’estimation du nombre de neurones dopaminergiques dans la substantia nigra est une méthode clé dans la recherche préclinique sur la maladie de Parkinson. Actuellement, le comptage stéréologique non biaisé est la norme pour la quantification de ces cellules, mais il reste un processus laborieux et long, qui peut ne pas être réalisable pour tous les projets. Ici, nous décrivons l’utilisation d’une plate-forme d’analyse d’image, qui peut estimer avec précision la quantité de cellules étiquetées dans une région d’intérêt prédéfinie. Nous décrivons un protocole étape par étape pour cette méthode d’analyse dans le cerveau de rat et démontrons qu’il peut identifier une réduction significative des neurones positifs d’hydroxylase de tyrosine dus à l’expression du mutant α-synuclein dans le nigra de substantia. Nous avons validé cette méthodologie en comparant avec les résultats obtenus par stéréologie impartiale. Prise ensemble, cette méthode fournit un processus rapide et précis pour détecter les changements dans le nombre de neurones dopaminergiques, et convient donc à une détermination efficace de l’effet des interventions sur la survie cellulaire.

Introduction

La maladie de Parkinson (MP) est une maladie du mouvement neurodégénérative répandue caractérisée par la présence d’agrégats protéiques contenant de la α-synucléine (α-syn) et la perte préférentielle de neurones dopaminergiques dans la substantia nigra pars compacta (SNpc)^1. La quantification du nombre de neurones dopaminergiques est une partie essentielle de la recherche sur la MP, car elle permet d’évaluer l’intégrité du système nigrostriatal, fournissant ainsi un critère d’évaluation important pour évaluer l’efficacité des traitements modificateurs de la maladie potentiels. Actuellement, la norme pour la quantification du nombre de cellules est le comptage stéréologique non biaisé, qui utilise des sections transversales bidimensionnelles (2D) du tissu pour estimer les caractéristiques volumétriques dans les structures tridimensionnelles (3D)^2,3,4. Les méthodes thétélogiques modernes basées sur la conception utilisent des procédures d’échantillonnage aléatoire complètes et appliquent des protocoles de comptage (connus sous le nom de sondes) pour éviter les artefacts potentiels et les erreurs systématiques, permettant une détection fiable des différences légèrement supérieures à la variation inter-animaux^5. Tandis que la stéréologie fournit un outil analytique puissant pour des études histologiques in vivo, elle prend beaucoup de temps, suppose la préparation uniforme d’échantillon, et exige la validation à plusieurs étapes, qui peut avoir un impact de plus en plus l’efficacité de plus en plus exigée pour l’investigation translationnelle préclinique.

Les progrès technologiques récents de la science numérique permettent d’adopter de nouvelles applications pour des évaluations plus efficaces de la pathologie sans stéréomicroscope, tout en comblant un besoin de substitut de la stéréologie impartiale. Ces méthodes augmentent la vitesse, réduisent l’erreur humaine et améliorent la reproductibilité des techniques téréologiques^6,7. HALO est l’une de ces plateformes d’analyse d’images pour l’analyse quantitative des tissus en pathologie numérique. Il comprend une variété de modules différents et rapporte des données d’expression morphologiques et multiplexées sur une base cellule par cellule à travers des sections entières de tissu utilisant des algorithmes de reconnaissance de formes. Le module FL cytonucléaire mesure la positivité immunofluorescente des marqueurs fluorescents dans le noyau ou le cytoplasme. Cela permet de signaler le nombre de cellules positives pour chaque marqueur et le score d’intensité pour chaque cellule. Le module peut être adapté pour fournir des mesures individuelles de la taille des cellules et de l’intensité, bien que cette fonctionnalité ne soit pas requise pour la quantification des neurones dopaminergiques.

Le but de cette étude est de vérifier cette méthode avec un modèle de rat α-syn à base de vecteur viral préalablement validé de neurodégénérescence^{nigrale 8,9,10.} Dans ce modèle, le mutant humain A53T α-syn est exprimé dans le SNpc par injection stéréotaxique du sérotype hybride adéno-associé du virus 1/2 (AAV1/2), entraînant une neurodégénérescence significative sur une période de 6 semaines. Le SNpc non injecté contralatéral peut, dans certaines études, servir de contrôle interne pour le côté injecté. Plus communément, l’injection de vecteur vide AAV (AAV-EV) dans une cohorte témoin d’animaux est utilisée comme témoin négatif. Nous présentons un guide étape par étape pour estimer la densité des neurones dopaminergiques restant dans le SNpc injecté après 6 semaines à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image automatisé (Figure 1).

Protocole

Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité des soins aux animaux du Réseau universitaire de santé et exécutées conformément aux lignes directrices et aux règlements établis par le Conseil canadien de protection des animaux.

1. Injection stéréotaxique

1. Couples de rats Sprague-Dawley femelles adultes (250-280 g) dans des cages avec litière en bois et accès ad lib à la nourriture et à l’eau. Maintenir la colonie animale dans un cycle clair/sombre régulier de 12 h (lumières à 06h30) avec une température et une humidité constantes.
2. Effectuer une injection stéréotaxique unilatérale d’AAV directement au SNpc sur le côté droit du cerveau (côté droit ou gauche, selon les préférences de chaque laboratoire) comme décrit précédemment^8,10. Injecter 2 μL d’AAV1/2 à un titre final de 3,4 x 10¹² particules génomiques/mL.

2. Sectionnement cérébral et immunohistochimie (CSI)

1. Anesthésier le rat avec 5% d’isoflurane en le plaçant dans une chambre anesthésiante pendant 3 min. D’autres méthodes approuvées peuvent être utilisées pour cette étape après un examen institutionnel approprié.
2. Une fois que le rat a atteint un plan chirurgical d’anesthésie profonde, transférez-le dans un cône de nez fermement fixé à une table d’autopsie. Fixez les pattes antérieures du rat à l’aide de ruban adhésif et utilisez la méthode de réponse au pincement des pincements pour déterminer la profondeur de l’anesthésie. L’animal doit ne pas répondre avant de continuer.
3. Faites une incision latérale sous le sternum et coupez à travers le diaphragme sur toute la longueur de la cage thoracique pour exposer la cavité pleurale. Soulevez et serrez le sternum avec un hémostatique et placez-le au-dessus de la tête.
4. Serrez le cœur à l’aide d’une pince et insérez une aiguille papillon reliée à une pompe de perfusion dans l’extrémité postérieure du ventricule gauche. Perfuser le rat transcardialement avec 150 ml de solution saline héparinisée, ou jusqu’à ce que les yeux et la peau soient clairs. La perfusion avec du paraformaldéhyde à 4% (PFA), au lieu d’une solution saline, peut être préférée pour faciliter l’immunomarquage avec certains anticorps ou une section plus mince du cerveau.
5. Une fois la perfusion terminée, décapiter avec une guillotine et extraire le cerveau vers une matrice cérébrale, surface ventrale tournée vers le haut.
6. À l’aide d’une lame de rasoir fraîche, faire une coupe dans le plan coronal 2 mm rostral au chiasme optique. Faites glisser la lame d’un côté à l’autre pour éviter de déformer le cerveau tout en tranchant.
7. Immerger la partie postérieure du cerveau dans un flacon pré-marqué contenant environ 20 mL de PFA à 4% pendant 48 h de post-fixation à température ambiante. La partie antérieure du cerveau peut être congelée instantanément dans du 2-méthylbutane réfrigéré à -42 °C avant d’être entreposée à -80 °C.
8. Après 48 h, transférer les cerveaux fixes dans un flacon marqué contenant 30% de saccharose dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et conserver à 4 °C jusqu’à ce qu’ils coulent (48-72 h).
9. Préparer un microtome en plaçant de la glace carbonique dans l’auge de l’échantillon, suivie d’éthanol à 100 %. Une fois l’étape refroidie, pressez le composé de température de coupe optimale (OCT) sur l’étape jusqu’à ce qu’il forme un cercle de 2 cm de diamètre et de 0,5 cm d’épaisseur. Une fois partiellement gelé, abaissez soigneusement le cerveau sur le monticule d’OCT, en veillant à ce que la surface de coupe striatale reste parallèle au stade.
10. Ajoutez plus de glace carbonique à la scène pour aider le cerveau à geler. Une fois que le cerveau a pris une couleur crème, effacez le stade de la glace carbonique.
11. Percez un trou dans le côté droit du cerveau avec une aiguille 25G pour distinguer les hémisphères droit et gauche. Veillez à ne pas passer l’aiguille à travers les structures anatomiques d’intérêt.
12. Couper en série des sections de 40 μm dans le plan coronal commençant à bregma -3,8 et se terminant à bregma -6,8.
13. Conservez six séries dans des tubes étiquetés avec une solution antigel (40% PBS, 30% 2-éthoxyéthanol, 30% glycérol). Chaque série doit contenir 12 sections du cerveau.
14. Sélectionnez un ensemble de sections pour la coloration immunohistochimique et lavez la solution antigel avec 3 x 10 lavages de minute dans 0,2% PBS-T.
15. Bloquer pendant 1 h à droite avec nutation douce en solution de blocage (10% sérum de chèvre normal (NGS), 2% d’albumine sérique bovine (BSA) dans 0,2% PBS-T). Suivez ceci avec l’incubation avec l’anticorps anti-tyrosine hydroxylase de lapin (TH) (1:500) et l’anticorps anti-α-syn de souris (1:500) dans 2% NGS dans 0.2% PBS-T pendant la nuit à température ambiante.
16. Laver l’anticorps primaire avec 3 x 5 lavages de minute dans 0,2% PBS-T, suivi d’une incubation de 1 h avec l’anticorps secondaire alexa fluor 488 anti-lapin de chèvre (1:500) et l’anticorps secondaire alexa fluor 555 anti-souris de chèvre dans 2% NGS dans 0,2% PBS-T. Assurez-vous que les sections sont protégées de la lumière et des noisettes doucement.
17. Lavez les anticorps secondaires avec des lavages de 3 x 5 minutes dans 0,2% PBS-T et montez l’ensemble complet des sections sur des lames protégées de la lumière et de la poussière à l’aide d’un pinceau étroit. Lamelle de couverture avec support de montage de fluorescence et joint avec vernis à ongles transparent.

3. Microscopie confocale et acquisition d’images

1. Capturez des images IHC à l’aide d’un logiciel couplé à un microscope confocal à un grossissement 10x. Ouvrez le trou d’épingle à 1,5 UA pour capturer un plan large totalisant ~ 1,5 μm et ouvrez la mise au point sur le côté injecté du cerveau.
2. Sous l’onglet Acquisition, cochez l’option d’imagerie Tile Scan (Analyse par vignettes) et définissez les dimensions sur 10 x 4.
3. Sous le panneau Mode d’acquisition, définissez le zoom sur 1.1. Cela permet d’éviter les marques d’assemblage évidentes entre les images de numérisation de tuiles.
4. Définissez la taille d’image sur 1024 x 1024 pixels et la moyenne sur 2 pour garantir l’acquisition d’images de haute qualité.
5. Dans le panneau Canaux, définissez la piste 1 sur Alexa488 et la piste 2 sur Alexa555.
6. Chargez la glissière sur la scène et choisissez une section avec une forte coloration TH. Cliquez sur Live dans le panneau Acquisition.
7. Dans le panneau Canaux, définissez la force et le gain laser sur des niveaux qui maximisent le signal et limitent le bruit de l’arrière-plan. Utilisez l’indicateur de portée pour vous assurer que les signaux ne sont pas surexposés (comme indiqué par une superposition rouge foncé).
8. Répétez l’étape ci-dessus avec plusieurs diapositives pour vous assurer que la coloration est cohérente entre les diapositives, car la force / le gain du laser ne peut pas être ajusté entre les diapositives.
9. Sous l’onglet Acquisition, cochez la case Positions.
10. À ce stade, vous êtes prêt à commencer l’imagerie. À l’aide de l’oculaire, choisissez la première section montrant une coloration TH positive, définissez la mise au point au point d’intérêt (c.-à-d. SNpc), puis déplacez la scène vers la ligne médiane de la section. Cela enregistre la position dans les axes x, y et z et image une analyse de tuiles capturant toute la section.
11. Répétez l’étape ci-dessus pour toutes les sections du SNpc en donnant un ensemble complet d’images du SNpc. Si une analyse détaillée du côté non injecté est requise, les étapes 3.10 à 3.11 doivent être répétées en mettant l’accent sur le côté non injecté.

4. Analyse et quantification d’images

1. Séparez les fichiers image à l’aide du logiciel approprié et importez les fichiers image dans un logiciel d’analyse d’image automatisé.
2. Définissez une région d’intérêt en sélectionnant l’outil d’annotation Plume pour dessiner une annotation autour du SNpc.
   REMARQUE: Dans les sections qui ont une grande quantité de perte de neurone dopaminergique, l’augmentation temporaire de l’émétence / absorption peut aider à définir clairement le SNpc (Figure 2).
3. Passez à l’onglet Analyse et dans le menu déroulant Analyser, sélectionnez Réglage en temps réel. Cela ouvre une fenêtre séparée sur l’image de la section permettant la modification en temps réel des paramètres d’analyse(Figure 3).
4. Sous la section Agrandissement de l’analyse, sélectionnez le zoom d’image approprié.
5. Dans la section Détection cellulaire, sélectionnez colorant nucléaire comme colorant utilisé pour la coloration TH (Alexa Fluor 488).
6. Ajustez les paramètres Seuil de contraste nucléaire, Intensité nucléaire minimale, Agressivitéde la segmentation nucléaire et Taille nucléaire tout en regardant attentivement la fenêtre réglage en temps réel.
   Remarque : représentation précise de chaque cellule individuelle comme une seule cellule dans la fenêtre de réglage en temps réel est essentielle pour la précision. Ces paramètres sont à une échelle arbitraire en fonction du logiciel utilisé, mais un ajustement correct est nécessaire pour permettre au logiciel de différencier avec précision les cellules individuelles et entre les cellules et l’arrière-plan (Figure 3).
7. Répétez ce processus avec un minimum de 10 échantillons distincts pour assurer un accord uniforme de ce qui constitue une cellule à travers différentes sections.
   Remarque : marqueurs de cellule supplémentaires (tels que α-syn ou NeuN) peuvent être identifiés dans la même plate-forme d’analyse à l’aide des sections marqueur 1 ou marqueur 2 sous l’onglet analyse.
8. Une fois qu’un nombre approprié d’images a été échantillonné et que le réglage en temps réel a été ajusté en conséquence, enregistrez les paramètres d’analyse dans le menu déroulant Actions de paramètres.
9. Sélectionnez toutes les images à analyser et cliquez sur Analyser.
10. Choisissez le paramètre d’analyse que vous venez d’enregistrer et, dans la fenêtre Région d’analyse, cochez la case Couche(s) d’annotations. Ensuite, vérifiez la couche 1 et cliquez sur En fonction analyser.
    REMARQUE: Pour un seul cerveau, l’analyse prend généralement environ 5 minutes. Le résultat obtenu affichera clairement chaque élément qui a été compté comme une cellule(Figure 4).
11. Une fois terminé, exportez les données d’analyse récapitulative pour toutes les sections. Il existe une option pour exporter des données d’analyse d’objet, qui donnera des données détaillées, y compris la taille de cellule de chaque cellule individuelle détectée. Cet ensemble de données pourrait être utilisé pour examiner les changements dans la taille des cellules en réponse à une toxine ou à un traitement.
12. Ajoutez le nombre total de cellules de chaque section analysée par animal et la surface totale analysée (mm^2). Divisez le nombre total de cellules par la surface totale analysée pour calculer le nombre de cellules/mm² dans le SNpc pour chaque rat

Résultats

En appliquant les méthodes ci-dessus au tissu cérébral collecté 6 semaines après les injections d’AAV, nous avons démontré que l’injection stéréotaxique d’AAV exprimant le mutant A53T α-syn (AAV-A53T) dans le SNpc du cerveau de rat entraîne une réduction significative de la densité des neurones dopaminergiques par rapport à l’injection d’AAV vectoriel vide (AAV-EV) comme contrôle(Figure 5A,B). Le nombre moyen de neurones/mm^{TH-positifs 2} da...

Discussion

L’évaluation fiable de l’intégrité du système dopaminergique dans les modèles précliniques de palladium est essentielle pour déterminer l’efficacité des traitements modificateurs de la maladie potentiels. Par conséquent, il est important de contrôler et de réduire au minimum les confusions potentielles qui peuvent réduire la fiabilité et la reproductibilité des données histopathologiques. Des résultats quantitatifs prudents peuvent fournir plus d’informations que les descriptions qualitatives ou s...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
A-Syn Antibody	ThermoFisher Scientific	32-8100
ABC Elite	Vector Labs	PK-6102
Alexa Fluor 488 secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-11008
Alexa Fluor 555 secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-28180
Alkaline phosphatase-conjugated anti-rabbit igG	Jackson Immuno	111-055-144
Biotinylated anti-mouse IgG	Vector Labs	BA-9200
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153
DAKO fluorescent mouting medium	Agilent	S3023
HALO™	Indica Labs
Histo-Clear II	Diamed	HS202
ImmPACT DAB Peroxidase substrate	Vector Labs	SK-4105
LSM880 Confocal Microscope	Zeiss
NeuN Antibody	Millipore	MAB377
Normal Goat Serum	Vector Labs	S-1000-20
OCT	Tissue-Tek
Paraformaldehyde	BioShop	PAR070.1
Sliding microtome	Leica	SM2010 R
Stereo Investigator	MBF Bioscience
Sucrose	BioShop	SUC700
TH Antibody	ThermoFisher Scientific	P21962
VectaMount mounting medium	Vector Labs	H-5000
Vector Blue Alkaline Phosphatase substrate	Vector Labs	SK-5300
Zen Black Software	Zeiss
Zen Blue Software	Zeiss