Determinación Semicuantita cuantitativa de la densidad de la neurona dopaminérgica en la sustancia negra de modelos de roedores utilizando el análisis automatizado de imágenes

Resumen

Aquí presentamos un método automatizado para la determinación semicuantita cuantitativa del número de neuronas dopaminérgicas en el compacta de las igualdades del nigra del substantia de la rata.

Resumen

La estimación del número de neuronas dopaminérgicas en el nigra del substantia es un método dominante en la investigación preclínica de la enfermedad de Parkinson. Actualmente, el conteo estereológico imparcial es el estándar para la cuantificación de estas células, pero sigue siendo un proceso laborioso y lento, que puede no ser factible para todos los proyectos. Aquí, describimos el uso de una plataforma de análisis de imágenes, que puede estimar con precisión la cantidad de celdas etiquetadas en una región predefinida de interés. Se describe un protocolo paso a paso para este método de análisis en el cerebro de rata y demostrar que puede identificar una reducción significativa en las neuronas positivas de la tirosina hidroxilasa debido a la expresión de mutante α-sinucleína en el nigra substantia. Se validó esta metodología mediante la comparación con los resultados obtenidos por estereología imparcial. En conjunto, este método proporciona un proceso eficiente en el tiempo y preciso para detectar cambios en el número de neuronas dopaminérgicas, y por lo tanto es adecuado para la determinación eficiente del efecto de las intervenciones en la supervivencia celular.

Introducción

La enfermedad de Parkinson (EP) es un trastorno del movimiento neurodegenerativo prevalente caracterizado por la presencia de agregados proteicos que contienen α-sinucleína (α-syn) y la pérdida preferencial de neuronas dopaminérgicas en la sustancia nigra pars compacta (SNpc)^1. La cuantificación del número de neuronas dopaminérgicas es una parte vital de la investigación de la EP, ya que permite la evaluación de la integridad del sistema nigroestriatal, lo que proporciona un criterio de valoración importante para evaluar la eficacia de la terapéutica potencial modificadora de la enfermedad. Actualmente, el estándar para la cuantificación del número celular es el conteo estereológico imparcial, que utiliza secciones transversales bidimensionales (2D) de tejido para estimar las características volumétricas en estructuras tridimensionales (3D)^2,3,4. Los métodos estereológicos modernos basados en el diseño emplean procedimientos integrales de muestreo aleatorio y aplican protocolos de conteo (conocidos como sondas) para evitar artefactos potenciales y errores sistemáticos, lo que permite la detección confiable de diferencias sólo ligeramente mayores que la variación entre animales⁵. Si bien la estereología proporciona una poderosa herramienta analítica para los estudios histológicos in vivo, requiere mucho tiempo, asume una preparación uniforme de la muestra y requiere validación en varios pasos, lo que puede afectar la eficiencia cada vez más requerida para la investigación traslacional preclínica.

Los recientes avances tecnológicos en la ciencia digital permiten adoptar nuevas aplicaciones para evaluaciones más eficientes de la patología sin un estereomicroscopio, al tiempo que se llena una necesidad como sustituto de la estereología imparcial. Estos métodos aumentan la velocidad, reducen el error humano y mejoran la reproducibilidad de las técnicas estereológicas^6,7. HALO es una de esas plataformas de análisis de imágenes para el análisis cuantitativo de tejidos en patología digital. Comprende una variedad de diferentes módulos e informes de expresión morfológica y multiplexada datos sobre una base de célula por célula a través de secciones de tejido entero utilizando algoritmos de reconocimiento de patrones. El módulo citonuclear FL mide la positividad inmunofluorescente de los marcadores fluorescentes en el núcleo o citoplasma. Esto permite informar del número de celdas positivas para cada marcador y la puntuación de intensidad para cada celda. El módulo se puede adaptar para proporcionar tamaños de célula individuales y mediciones de intensidad, aunque esta característica no es necesaria para la cuantificación de las neuronas dopaminérgicas.

El objetivo de este estudio es verificar este método con un modelo de neurodegeneración nigral previamente validado basado en vectores α-syn de neurodegeneración^{nigral 8,9,10.} En este modelo, el mutante humano A53T α-syn se expresa en el SNpc por inyección estereotáctica del serotipo híbrido de virus adenoasociado 1/2 (AAV1/2), lo que resulta en una neurodegeneración significativa durante un período de 6 semanas. El SNpc no inyectado contralateral puede, en algunos estudios, servir como un control interno para el lado inyectado. Más comúnmente, la inyección de AAV-Empty Vector (AAV-EV) en una cohorte de control de animales se utiliza como un control negativo. Presentamos una guía paso a paso para estimar la densidad de neuronas dopaminérgicas que permanecen en el SNpc inyectado después de 6 semanas utilizando un software de análisis de imágenes automatizado(Figura 1).

Protocolo

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Red de Salud de la Universidad y se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones establecidas por el Consejo Canadiense de Cuidado Animal.

1. Inyección estereotáctica

1. Ratas Sprague-Dawley hembras adultas de casas de pareja (250-280 g) en jaulas con ropa de cama de madera y acceso ad lib a alimentos y agua. Mantener la colonia de animales en un ciclo regular de luz/oscuridad de 12 h (luces encendidas a las 06:30) con temperatura y humedad constantes.
2. Realizar la inyección estereotáctica unilateral de AAV directamente al SNpc en el lado derecho del cerebro (lado derecho o izquierdo, según las preferencias de cada laboratorio) como se describió anteriormente^8,10. Inyecte 2 μL de AAV1/2 a un título final de 3,4 x 10¹² partículas genómicas/mL.

2. Seccionamiento cerebral e inmunohistoquímica (IHC)

1. Anestesiar a la rata con isoflurano al 5% colocándola en una cámara anestesizante durante 3 min. Otros métodos aprobados pueden ser utilizados para este paso después de la revisión institucional apropiada.
2. Una vez que la rata ha alcanzado un plano quirúrgico de anestesia profunda, transfiéranlo a un cono de nariz firmemente fijado a una mesa de necropsia. Asegure las patas de la parte anterior de la rata usando cinta adhesiva y use el método de respuesta de pellizco del dedo del perro para determinar la profundidad de la anestesia. El animal debe no responder antes de continuar.
3. Haga una incisión lateral debajo del esternón y corte el diafragma a lo largo de toda la longitud de la caja torácica para exponer la cavidad pleural. Levante y sujete el esternón con un hemóstato y colótelo encima de la cabeza.
4. Sujete el corazón con pinzas e inserte una aguja de mariposa conectada a una bomba de perfusión en el extremo posterior del ventrículo izquierdo. Perfundir rata transcardialmente con 150 mL de solución salina heparinizada, o hasta que los ojos y la piel estén claros. La perfusión con el paraformaaldehído del 4% (PFA), en vez de salino, se puede preferir para facilitar immunostaining con ciertos anticuerpos o el seccionamiento más fino del cerebro.
5. Una vez completada la perfusión, decapitar con una guillotina y extraer el cerebro a una matriz cerebral, superficie ventral hacia arriba.
6. Usando una cuchilla de afeitar fresca, hacer un corte en el plano coronal 2 mm rostral al quiasma óptico. Deslice la cuchilla de lado a lado para evitar deformar el cerebro mientras se corta.
7. Sumergir la porción posterior del cerebro en un vial pre-etiquetado que contenga aproximadamente 20 mL de PFA al 4% durante 48 h de post-fijación a temperatura ambiente. La porción anterior del cerebro puede congelarse en 2-metilbutano refrigerado a -42 °C antes de su almacenamiento a -80 °C.
8. Después de 48 h, transferir los cerebros fijos a un vial marcado que contiene sacarosa al 30% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y almacenarlos a 4 °C hasta que se hundan (48-72 h).
9. Prepare un microtoma colocando hielo seco en el canal de la etapa de la muestra, seguido de etanol al 100%. Una vez que la etapa se ha enfriado, apriete el compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) en la etapa hasta que forme un círculo de 2 cm de diámetro y 0,5 cm de espesor. Una vez que se ha congelado parcialmente, baje cuidadosamente el cerebro sobre el montículo de OCT, asegurando que la superficie de corte estriatal permanezca paralela a la etapa.
10. Agregue más hielo seco al escenario para ayudar al cerebro a congelarse. Una vez que el cerebro se ha vuelto de un color crema, despeje la etapa de hielo seco.
11. Haga un agujero en el lado derecho del cerebro con una aguja 25G para distinguir los hemisferios derecho e izquierdo. Tenga cuidado de no pasar la aguja a través de estructuras anatómicas de interés.
12. Cortar en serie secciones de 40 μm en el plano coronal comenzando en bregma -3.8 y terminando en bregma -6.8.
13. Guarde seis series en tubos etiquetados con solución anticongelante (40% PBS, 30% 2-etoxietanol, 30% glicerol). Cada serie debe contener 12 secciones cerebrales.
14. Seleccione un conjunto de secciones para la tinción inmunohistoquímica y lave la solución anticongelante con lavados de 3 x 10 min en PBS-T al 0,2%.
15. Bloque para 1 h en el RT con la nutación suave en la solución de bloqueo (suero normal de la cabra del 10% (NGS), albúmina de suero bovino del 2% (BSA) en 0,2% PBS-T). Siga esto con la incubación con el anticuerpo anti-tirosina hidroxilasa del conejo (TH) (1:500) y el anticuerpo anti-α-syn del ratón (1:500) en ngs del 2% en pbs-t del 0,2% durante la noche en la temperatura ambiente.
16. Lave el anticuerpo primario con lavados de 3 x 5 min en PBS-T al 0,2%, seguido de una incubación de 1 h con anticuerpo secundario Anti-conejo Alexa Fluor 488 de cabra (1:500) y anticuerpo secundario Anti-ratón Alexa Fluor 555 de cabra en NGS al 2% en PBS-T al 0,2%. Asegúrese de que las secciones estén protegidas de la luz y de la nuez suavemente.
17. Lave los anticuerpos secundarios con lavados de 3 x 5 min en PBS-T al 0,2% y monte el conjunto completo de secciones en portaobjetos protegidos de la luz y el polvo con un pincel estrecho. Cubrebocas con medio de montaje de fluorescencia y sello con barniz de uñas transparente.

3. Microscopía confocal y adquisición de imágenes

1. Capture imágenes IHC utilizando un software acoplado a un microscopio confocal a un aumento de 10x. Abra el agujero de alfiler a 1.5 UA para capturar un plano ancho que totalizara ~ 1.5 μm y establezca el enfoque en el lado inyectado del cerebro.
2. En la pestaña Adquisición, active la opción Imágenes de escaneo de teselas y establezca las dimensiones en 10 x 4.
3. En el panel Modo de adquisición, establezca el Zoom en 1.1. Esto ayuda a evitar cualquier marca de costura obvia entre las imágenes de escaneo de mosaicos.
4. Establezca el Tamaño de fotograma en 1024 x 1024 píxeles y el Promedio en 2 para garantizar la adquisición de imágenes de alta calidad.
5. En el panel Canales, establezca la pista 1 en Alexa488 y la pista 2 en Alexa555.
6. Cargue la diapositiva en el escenario y elija una sección con una fuerte tinción de TH. Haga clic en En vivo en el panel Adquisición.
7. En el panel Canales, establezca la Fuerza y ganancia del láser en niveles que maximicen la señal y limiten el ruido del fondo. Utilice el indicador de rango para asegurarse de que las señales no están sobreexpuestas (como lo indica una superposición de color rojo oscuro).
8. Repita el paso anterior con varias diapositivas para asegurarse de que la tinción sea consistente entre las diapositivas, ya que la fuerza/ganancia del láser no se puede ajustar entre las diapositivas.
9. En la pestaña Adquisición, active la casilla Posiciones.
10. En este punto, usted está listo para comenzar la toma de imágenes. Usando el ocular, elija la primera sección que muestra una tinción de TH positiva, establezca el enfoque en el punto de interés (es decir, SNpc) y luego mueva el escenario a la línea media de la sección. Esto guarda la posición en los ejes x, y y z y creará una imagen de un escaneo de mosaico que captura toda la sección.
11. Repita el paso anterior para todas las secciones a lo largo del SNpc dando un conjunto completo de imágenes del SNpc. Si se requiere un análisis detallado del lado no inyectado, los pasos 3.10 a 3.11 deben repetirse estableciendo el enfoque en el lado no inyectado.

4. Análisis de imágenes y cuantificación

1. Separe los archivos de imagen utilizando el software adecuado e importe los archivos de imagen al software de análisis de imágenes automatizado.
2. Defina una región de interés seleccionando la herramienta De anotación Pluma para dibujar una anotación alrededor del SNpc.
   NOTA: En las secciones que tienen una gran cantidad de pérdida de neuronas dopaminérgicas, el aumento temporal de la emisión / absorción puede ayudar a definir claramente el SNpc (Figura 2).
3. Desplácese hasta la pestaña Análisis y, en el menú desplegable Analizar, seleccione Ajuste en tiempo real. Esto abre una ventana separada en la imagen de la sección que permite la modificación en tiempo real de los parámetros de análisis (Figura 3).
4. En la sección Ampliación de análisis, seleccione el zoom de imagen adecuado.
5. En la sección Detección celular, seleccione el tinte nuclear como el tinte utilizado para la tinción de TH (Alexa Fluor 488).
6. Ajuste los ajustes de Umbral de contraste nuclear, Intensidad nuclear mínima, Agresividadde segmentación nuclear y Tamaño nuclear mientras observa cuidadosamente la ventana Ajuste en tiempo real.
   Nota: La representación precisa de cada celda individual como una sola celda en la ventana de ajuste en tiempo real es vital para la precisión. Estos ajustes son a una escala arbitraria dependiendo del software utilizado, pero se necesita un ajuste correcto para permitir que el software diferencie con precisión entre celdas individuales, y entre celdas y el fondo (Figura 3).
7. Repita este proceso con un mínimo de 10 muestras separadas para garantizar una concordancia uniforme de lo que constituye una célula en diferentes secciones.
   NOTA: Los marcadores de celda adicionales (como α-syn o NeuN) se pueden identificar dentro de la misma plataforma de análisis mediante las secciones Marcador 1 o Marcador 2 de la ficha análisis.
8. Una vez que se haya muestreado un número adecuado de imágenes y se haya ajustado en tiempo real en consecuencia, guarde la configuración de análisis en el menú desplegable Acciones de configuración.
9. Seleccione todas las imágenes que se analizarán y haga clic en Analizar.
10. Elija la configuración de análisis que acaba de guardar y, en la ventana Región de análisis, marque la casilla Capas de anotación. Luego, marque la Capa 1 y haga clic en Analizar.
    NOTA: Para un solo cerebro, el análisis suele tardar unos 5 minutos. El resultado completado mostrará claramente cada elemento que se ha contado como una celda (Figura 4).
11. Una vez completado, exporte los datos de análisis de resumen para todas las secciones. Hay una opción para exportar datos de análisis de objetos,que proporcionará datos detallados, incluido el tamaño de celda de cada celda individual detectada. Este conjunto de datos podría utilizarse para examinar los cambios en el tamaño celular en respuesta a una toxina/terapéutica.
12. Agregue las Celdas Totales de cada sección analizada por animal y el Área Total Analizada (mm²). Divida el número total de células por el área total analizada para calcular el número de células/mm² en el SNpc para cada rata

Resultados

Mediante la aplicación de los métodos anteriores al tejido cerebral recogido 6 semanas después de las inyecciones de AAV, hemos demostrado que la inyección estereotáctica de AAV que expresa el mutante A53T α-syn (AAV-A53T) en el SNpc del cerebro de rata resulta en una reducción significativa en la densidad de las neuronas dopaminérgicas en comparación con la inyección del vector vacío AAV (AAV-EV) como un control(Figura 5A,B). El número malo de neuronas TH-positi...

Discusión

La evaluación confiable de la integridad del sistema dopaminérgico en modelos preclínicos del paladio es crítica determinar la eficacia de la terapéutica enfermedad-que modifica potencial. Por lo tanto, es importante controlar y minimizar las posibles confundciones que pueden reducir la fiabilidad y reproducibilidad de los datos histopatológicos. Los resultados cuantitativos cuidadosos pueden proporcionar más información que las descripciones cualitativas o semicuantitaticas por sí solas. Al mismo tiempo, debemo...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
A-Syn Antibody	ThermoFisher Scientific	32-8100
ABC Elite	Vector Labs	PK-6102
Alexa Fluor 488 secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-11008
Alexa Fluor 555 secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-28180
Alkaline phosphatase-conjugated anti-rabbit igG	Jackson Immuno	111-055-144
Biotinylated anti-mouse IgG	Vector Labs	BA-9200
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153
DAKO fluorescent mouting medium	Agilent	S3023
HALO™	Indica Labs
Histo-Clear II	Diamed	HS202
ImmPACT DAB Peroxidase substrate	Vector Labs	SK-4105
LSM880 Confocal Microscope	Zeiss
NeuN Antibody	Millipore	MAB377
Normal Goat Serum	Vector Labs	S-1000-20
OCT	Tissue-Tek
Paraformaldehyde	BioShop	PAR070.1
Sliding microtome	Leica	SM2010 R
Stereo Investigator	MBF Bioscience
Sucrose	BioShop	SUC700
TH Antibody	ThermoFisher Scientific	P21962
VectaMount mounting medium	Vector Labs	H-5000
Vector Blue Alkaline Phosphatase substrate	Vector Labs	SK-5300
Zen Black Software	Zeiss
Zen Blue Software	Zeiss