Otomatik Görüntü Analizi Kullanılarak Kemirgen Modellerinin Substantia Nigra'sında Dopaminerjik Nöron Yoğunluğunun Yarı Nicel Belirlenmesi

Özet

Burada sıçan substantia nigra pars compacta dopaminerjik nöron sayısının yarı nicel belirlenmesi için otomatik bir yöntem sunuyoruz.

Özet

Substantia nigradaki dopaminerjik nöronların sayısının tahmin edilmesi klinik öncesi Parkinson hastalığı araştırmalarında önemli bir yöntemdir. Şu anda, tarafsız stereolojik sayım bu hücrelerin ölçülmesi için standarttır, ancak tüm projeler için mümkün olmayabilecek zahmetli ve zaman alıcı bir süreç olmaya devam etmektedir. Burada, önceden tanımlanmış bir ilgi alanında etiketli hücrelerin miktarını doğru bir şekilde tahmin edebilen bir görüntü analizi platformunun kullanımını açıklıyoruz. Sıçan beyninde bu analiz yöntemi için adım adım bir protokol açıklıyoruz ve substantia nigradaki mutant α-sinüklein ekspresyumu nedeniyle tirozin hidroksilaz pozitif nöronlarında önemli bir azalma tanımlayabileceğini gösteriyoruz. Bu metodolojiyi tarafsız stereoloji ile elde edilen sonuçlarla karşılaştırarak doğruladık. Birlikte ele alındığında, bu yöntem dopaminerjik nöron sayısındaki değişiklikleri tespit etmek için zaman verimli ve doğru bir süreç sağlar ve bu nedenle müdahalelerin hücre sağkalımı üzerindeki etkisinin verimli bir şekilde belirlenmesi için uygundur.

Giriş

Parkinson hastalığı (PD), α-sinüklein (α-syn) içeren protein agregalarının varlığı ve substantia nigra pars compacta (SNpc)^1'dedopaminerjik nöronların tercihli kaybı ile karakterize yaygın bir nörodejeneratif hareket bozukluğudur. Dopaminerjik nöron sayısının ölçülmesi, nigrostriatal sistemin bütünlüğünün değerlendirilmesine izin verdiği için PD araştırmasının hayati bir parçasıdır, bu nedenle potansiyel hastalık değiştirici terapötiklerin etkinliğini değerlendirmek için önemli bir uç nokta sağlar. Şu anda, hücre sayısının ölçülmesi için standart, üç boyutlu (3D) yapılarda hacimsel özellikleri tahmin etmek için dokunun iki boyutlu (2D) kesitlerini kullanan tarafsız stereolojik^{sayımdır 2,3,4}. Modern tasarım tabanlı stereolojik yöntemler, kapsamlı rastgele örnekleme prosedürleri uygular ve potansiyel yapıtları ve sistematik hataları önlemek için sayım protokolleri (problar olarak bilinir) uygular ve farklılıkların hayvanlar arası varyasyondan sadece biraz daha büyük güvenilir bir şekilde tespit edilmesine izin verir⁵. Stereology in vivo histolojik çalışmalar için güçlü bir analitik araç sağlarken, zaman yoğundur, tek tip numune hazırlamayı varsayar ve klinik öncesi çevirisel araştırma için giderek daha fazla gerekli olan verimliliği etkileyebilecek birkaç adımda doğrulama gerektirir.

Dijital bilimdeki son teknolojik gelişmeler, bir yandan stereomikroskop olmadan patolojinin daha verimli değerlendirilmesi için yeni uygulamaların benimsenmesini mümkün getirirken, bir yandan da tarafsız stereolojinin bir vekili olarak bir ihtiyacı dolduruyor. Bu yöntemler hızı arttırır, insan hatasını azaltır vesterolojik tekniklerin tekrarlanabilirliğini artırır^6,7. HALO, dijital patolojide nicel doku analizi için böyle bir görüntü analizi platformudur. Çeşitli modüllerden oluşur ve örüntü tanıma algoritmalarını kullanarak tüm doku bölümlerinde hücre bazında morfolojik ve çoklanmış ifade verilerini raporlar. Cytonükleer FL modülü, çekirdek veya sitoplazmadaki floresan belirteçlerin immünofluoresan pozitifliğini ölçer. Bu, her işaretleyici için pozitif hücre sayısının ve her hücrenin yoğunluk puanının bildirilmesini sağlar. Modül, dopaminerjik nöronların ölçülmesi için gerekli olmasa da, bireysel hücre boyutları ve yoğunluk ölçümleri sağlamak için uyarlanabilir.

Bu çalışmanın amacı, nigral nörodejenerasyon 8 ,^9,10'undahaönce doğrulanmış viral vektör bazlı α-syn sıçan modeli ile bu yöntemi doğrulamaktır. Bu modelde, insan mutant A53T α-syn, SNpc'de adeno ilişkili virüs hibrid serotip 1/2'nin (AAV1/2) stereotaktik enjeksiyonu ile ifade edilir ve 6 haftalık bir süre boyunca önemli nörodejenerasyon ile sonuçlanır. Kontrallateral uninjected SNpc, bazı çalışmalarda, enjekte edilen taraf için bir iç kontrol görevi görebilir. Daha yaygın olarak, hayvanların bir kontrol kohortuna AAV-Boş Vektör (AAV-EV) enjeksiyonu negatif kontrol olarak kullanılır. Otomatik bir görüntü analiz yazılımı kullanarak 6 hafta sonra enjekte edilen SNpc'de kalan dopaminerjik nöronların yoğunluğunu tahmin etmek için adım adım bir kılavuz sunuyoruz (Şekil 1).

Protokol

Tüm prosedürler Üniversite Sağlık Ağı Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylandı ve Kanada Hayvan Bakımı Konseyi tarafından belirlenen kılavuz ve yönetmeliklere uygun olarak gerçekleştirildi.

1. Stereotaktik enjeksiyon

1. Çift ev yetişkin dişi Sprague-Dawley sıçanları (250-280 g) ahşap yatak ve yiyecek ve suya ad lib erişimi ile kafeslerde. Hayvan kolonisini sabit sıcaklık ve nem ile düzenli 12 saat açık / karanlık döngüde (06:30'da ışıklar) koruyun.
2. AAV'nin tek taraflı stereotaktik enjeksiyonunun doğrudan beynin sağ tarafındaki SNpc'ye (her laboratuvarın tercihlerine göre sağ veya sol taraf) daha önce açıklandığı gibi^8,10. 3,4 x 10 12 genomik parçacık/mL'lik son titreye^{2 μL AAV1/2} enjekte edin.

2. Beyin kesit ve immünostokimya (IHC)

1. 3 dakika boyunca bir anestezi odasına yerleştirerek sıçanı% 5 izofluran ile uyuşturun. Uygun kurumsal incelemeden sonra bu adım için onaylanan diğer yöntemler kullanılabilir.
2. Sıçan derin anestezinin cerrahi bir düzlemine ulaştığında, nekropsi masasına sıkıca yapıştırılmış bir burun konisine aktarın. Farenin fore-paws bant kullanarak sabitleyin ve anestezinin derinliğini belirlemek için parmak sıkışma tepki yöntemini kullanın. Hayvan devam etmeden önce tepkisiz olmalıdır.
3. Sternumun altında yanal bir kesi yapın ve plevral boşluğu açığa çıkarmak için göğüs kafesinin tüm uzunluğu boyunca diyaframı kesin. Sternumu bir hemostatla kaldırın ve kelepçeleyin ve başın üzerine yerleştirin.
4. Kalbi tokalar kullanarak sıkıştırın ve perfüzyon pompasına bağlı bir kelebek iğnesini sol ventrikülün arka ucuna yerleştirin. Sıçanı transkardiyöz olarak 150 mL heparinize salin ile veya gözler ve cilt temizlenene kadar perfuse. Bazı antikorlar veya daha ince beyin kesileri ile immün yetinmeyi kolaylaştırmak için salin yerine %4 paraformaldehit (PFA) ile perfüzyon tercih edilebilir.
5. Perfüzyon tamamlandıktan sonra, bir giyotinle kafalarını koparın ve beyni bir beyin matrisine, ventral yüzeye bakacak şekilde çıkarın.
6. Taze bir jilet kullanarak, koronal düzlemde optik chiasm'a 2 mm rostral bir kesim yapın. Dilimleme yaparken beynin çarpıtılmasını önlemek için bıçağı bir yandan diğer yana kaydırın.
7. Beynin arka kısmını, oda sıcaklığında 48 saat sonra sabitleme için yaklaşık 20 mL% 4 PFA içeren önceden etiketlenmiş bir şişeye batırın. Beynin ön kısmı -80 °C'de depolanmadan önce -42 °C'ye soğutulmuş 2-metilbütan içinde donmuş olabilir.
8. 48 saat sonra, sabit beyinleri fosfat tamponlu salin (PBS) içinde% 30 sakkaroz içeren etiketli bir şişeye aktarın ve batana kadar (48-72 saat) 4 °C'de saklayın.
9. Numune aşamasının oluğuna kuru buz ve ardından% 100 etanol yerleştirerek bir mikrotom hazırlayın. Sahne soğuduktan sonra, 2 cm çapında ve 0,5 cm kalınlığında bir daire oluşturana kadar optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiği sahnenin üzerine sıkın. Kısmen donduktan sonra, beyni OCT höyüğüne dikkatlice dirakle ve striatal kesme yüzeyinin aşamaya paralel kalmasını sağlayın.
10. Beynin donmasına yardımcı olmak için sahneye daha fazla kuru buz ekleyin. Beyin krem rengine döndükten sonra, kuru buzun aşamasını temizleyin.
11. Sağ ve sol yarımküreleri ayırt etmek için 25G iğne ile beynin sağ tarafına bir delik açın. İğneyi ilgi çekici anatomik yapılardan geçirmemeye özen göster.
12. Bregma -3.8'den başlayıp bregma -6.8'de biten koronal düzlemde seri olarak 40 μm kesitler kesin.
13. Altı seriyi anti-freeze çözeltili etiketli tüplerde saklayın (%40 PBS, %30 2-etoksiyethanol, %30 gliserol). Her seri 12 beyin bölümü içermelidir.
14. İmmünohistokimyasal boyama için bir bölüm kümesi seçin ve %0,2 PBS-T'de 3 x 10 dakikalık yıkamalarla donma önleyici çözeltiyi yıkayın.
15. Blokaj çözeltisinde (%10 normal keçi serumu (NGS), %0,2 PBS-T'de %2 sığır serumu albümin (BSA) ile RT'de 1 saat boyunca blok. Bunu, oda sıcaklığında gece boyunca %0,2 PBS-T'de % 2 NGS'de tavşan anti-tirozin hidroksilaz (TH) antikor (1:500) ve fare anti-α-syn antikor (1:500) ile inkübasyon ile takip edin.
16. Birincil antikoru % 0.2 PBS-T'de 3 x 5 dakikalık yıkamalarla yıkayın, ardından keçi anti-tavşan Alexa Fluor 488 ikincil antikor (1:500) ve keçi anti-fare Alexa Fluor 555 ikincil antikor ile% 2 NGS'de% 0.2 PBS-T'de 1 saat inkübasyon. Bölümlerin ışıktan ve hafifçe fındıklamadan korunduğundan emin olun.
17. İkincil antikoru %0,2 PBS-T'de 3 x 5 dakikalık yıkamalarla yıkayın ve dar bir boya fırçası kullanarak ışık ve tozdan korunan slaytlara tüm bölüm setini monte edin. Floresan montajlı kapakçık ve berrak tırnak verniği ile mühürleyin.

3. Konfokal mikroskopi ve görüntü alımı

1. 10x büyütmede konfokal mikroskopla birleştirilmiş yazılımı kullanarak IHC görüntülerini yakalayın. Toplam ~1,5 μm'lik geniş bir düzlemi yakalamak için iğne deliğini 1,5 AU'ya açın ve odağı beynin enjekte edilen tarafına ayarlayın.
2. Edinme sekmesinde Döşeme Taraması görüntüleme seçeneğini işaretleyin ve boyutları 10 x 4 olarak ayarlayın.
3. Edinme Modu panelinin altında Yakınlaştırma'yı 1.1 olarak ayarlayın. Bu, döşeme tarama görüntüleri arasında belirgin dikiş izlerini önlemeye yardımcı olur.
4. Yüksek kaliteli görüntü alımını sağlamak için Çerçeve Boyutunu 1024 x 1024 piksel ve Ortalamayı 2 olarak ayarlayın.
5. Kanallar panelinde, parça 1'i Alexa488'e ve 2.
6. Slaydı sahne alanına yükleyin ve güçlü TH boyamaya sahip bir bölüm seçin. Edinme panelinde Canlı'ya tıklayın.
7. Kanallar panelinde, Lazer Gücü ve Kazancı'nı sinyali en üst düzeye çıkaran ve arka plandan gelen gürültüyü sınırlayan seviyelere ayarlayın. Sinyallerin aşırı pozlanmadığından emin olmak için aralık göstergesini kullanın (koyu kırmızı kaplamada belirtildiği gibi).
8. Lazer gücü/kazancı slaytlar arasında ayarlanamadığından, lekelemenin slaytlar arasında tutarlı olduğundan emin olmak için yukarıdaki adımı birden fazla slaytla tekrarlayın.
9. Edinme sekmesinde Pozisyonlar kutusunu işaretleyin.
10. Bu noktada, görüntülemeye başlamaya hazırsınız. Göz merceği kullanarak, pozitif TH boyama gösteren ilk bölümü seçin, odağı ilgi çekici noktaya (yani SNpc) ayarlayın ve ardından sahneyi bölümün orta çizgisine taşıyın. Bu, x, y ve z eksenlerindeki konumu kaydeder ve tüm bölümü yakalayan bir döşeme taraması görüntüler.
11. SNpc boyunca tüm bölümler için yukarıdaki adımı tekrarlayın ve SNpc'nin tam bir görüntü kümesini verin. İstenmeyen tarafın ayrıntılı analizi gerekiyorsa, odağın seçilmemiş tarafa ayarlanmasıyla 3.10 ile 3.11 adımları tekrarlanmalıdır.

4. Görüntü analizi ve nicelik

1. Uygun yazılımı kullanarak görüntü dosyalarını ayır ve görüntü dosyalarını otomatik görüntü analizi yazılımına içe aktarın.
2. SNpc'nin etrafına ek açıklama çizmek için Kalem ek açıklama aracını seçerek ilgi çekici bir bölge tanımlayın.
   NOT: Çok miktarda dopaminerjik nöron kaybı olan bölümlerde, yayılmayı / emilimi geçici olarak artırmak SNpc'yi net bir şekilde tanımlamaya yardımcı olabilir (Şekil 2).
3. Çözümleme sekmesine gidin ve açılır Çözümle menüsünden Gerçek Zamanlı Ayarlama 'yıseçin. Bu, bölüm görüntüsünde analiz parametrelerinin gerçek zamanlı olarak değiştirilmesine izin verilen ayrı bir pencere açar (Şekil 3).
4. Analiz Büyütme bölümünün altında uygun görüntü yakınlaştırmasını seçin.
5. Hücre Algılama bölümünde, TH boyama için kullanılan boya olarak nükleer boyayı seçin (Alexa Fluor 488).
6. Gerçek Zamanlı Ayarlama penceresini dikkatle izlerken Nükleer Kontrast Eşiği, Minimum Nükleer Yoğunluk, Nükleer Segmentasyon Agresifliğive Nükleer Boyut ayarlarını yapın.
   NOT: Her bir hücrenin Gerçek Zamanlı Ayarlama penceresinde tek bir hücre olarak doğru bir şekilde temsil edilmesi doğruluk açısından hayati önem taşır. Bu ayarlar kullanılan yazılıma bağlı olarak rasgele bir ölçektedir, ancak yazılımın tek tek hücreler arasında ve hücreler ile arka plan arasında doğru bir şekilde ayırt etmesine izin vermek için doğru ayarlama gereklidir (Şekil 3).
7. Farklı bölümlerde bir hücreyi oluşturan şeyin tekdüze bir şekilde kabul etmesini sağlamak için bu işlemi en az 10 ayrı örnekle tekrarlayın.
   NOT: Ek hücre işaretleyicileri (α-syn veya NeuN gibi) analiz sekmesindeki İşaretçi 1 veya İşaretçi 2 bölümleri kullanılarak aynı analiz platformunda tanımlanabilir.
8. Uygun sayıda görüntü örneklendikten ve Gerçek Zamanlı Ayarlama buna göre ayarlandıktan sonra, analiz ayarlarını Ayarlar Eylemleri açılır menüsüne kaydedin.
9. Analiz edilecek tüm görüntüleri seçin ve Analiz Et 'itıklatın.
10. Yeni kaydettiğiniz analiz ayarını seçin ve Analiz Bölgesi penceresinde Ek Açıklama Katmanları kutusunu işaretleyin. Ardından Katman 1'i kontrol edin ve Çözümle 'yitıklatın.
    NOT: Tek bir beyin için analiz genellikle yaklaşık 5 dakika sürer. Tamamlanan sonuç, hücre olarak sayılan her öğeyi açıkça gösterecektir (Şekil 4).
11. Tamamlandıktan sonra, tüm bölümler için özet analiz verilerini dışa aktarabilirsiniz. Nesne Çözümleme Verileriniverme seçeneği , algılanan her bir hücrenin hücre boyutu da dahil olmak üzere ayrıntılı veriler verecektir. Bu veri kümesi, bir toksin/terapötik yanıt olarak hücre boyutundaki değişiklikleri incelemek için kullanılabilir.
12. Hayvan başına analiz edilen her bölümden Toplam Hücreleri ve Toplam Analiz Edilen Alanı (mm²⁾ekleyin. Her sıçan için SNpc'deki hücre/mm² sayısını hesaplamak için toplam hücre sayısını analiz edilen toplam alana bölün

Sonuçlar

Yukarıdaki yöntemleri AAV enjeksiyonlarından 6 hafta sonra toplanan beyin dokusuna uygulayarak, sıçan beyninin SNpc'sinde mutant A53T α-syn (AAV-A53T) ifade eden AAV'nin stereotaktik enjeksiyonunun, kontrol olarak boş vektör AAV (AAV-EV) enjeksiyonuna kıyasla dopaminerjik nöronların yoğunluğunda önemli bir azalmaya neden olduğunu gösterdik (Şekil 5A,B). AAV-EV enjekte edilen sıçanların SNpc'sinde ortalama TH pozitif nöron/mm² sayısı 276.2 ±...

Tartışmalar

PD'nin klinik öncesi modellerinde dopaminerjik sistemin bütünlüğünün güvenilir bir şekilde değerlendirilmesi, potansiyel hastalık değiştirici terapötiklerin etkinliğini belirlemek için kritik öneme sahiptir. Bu nedenle, histopatolojik verilerin güvenilirliğini ve tekrarlanabilirliğini azaltabilecek potansiyel kafa karıştırıcıları kontrol etmek ve en aza indirmek önemlidir. Dikkatli nicel sonuçlar, tek başına nitel veya yarı nicel açıklamalardan daha fazla bilgi sağlayabilir. Aynı zamand...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
A-Syn Antibody	ThermoFisher Scientific	32-8100
ABC Elite	Vector Labs	PK-6102
Alexa Fluor 488 secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-11008
Alexa Fluor 555 secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-28180
Alkaline phosphatase-conjugated anti-rabbit igG	Jackson Immuno	111-055-144
Biotinylated anti-mouse IgG	Vector Labs	BA-9200
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153
DAKO fluorescent mouting medium	Agilent	S3023
HALO™	Indica Labs
Histo-Clear II	Diamed	HS202
ImmPACT DAB Peroxidase substrate	Vector Labs	SK-4105
LSM880 Confocal Microscope	Zeiss
NeuN Antibody	Millipore	MAB377
Normal Goat Serum	Vector Labs	S-1000-20
OCT	Tissue-Tek
Paraformaldehyde	BioShop	PAR070.1
Sliding microtome	Leica	SM2010 R
Stereo Investigator	MBF Bioscience
Sucrose	BioShop	SUC700
TH Antibody	ThermoFisher Scientific	P21962
VectaMount mounting medium	Vector Labs	H-5000
Vector Blue Alkaline Phosphatase substrate	Vector Labs	SK-5300
Zen Black Software	Zeiss
Zen Blue Software	Zeiss