Determinazione semi-quantitativa della densità neuronale dopaminergica nella Substantia Nigra dei modelli di roditori utilizzando l'analisi automatizzata delle immagini

Riepilogo

Qui presentiamo un metodo automatizzato per la determinazione semi-quantitativa del numero di neuroni dopaminergici nella substantia nigra pars compacta del ratto.

Abstract

La stima del numero di neuroni dopaminergici nella substantia nigra è un metodo chiave nella ricerca pre-clinica sul morbo di Parkinson. Attualmente, il conteggio stereologico imparziale è lo standard per la quantificazione di queste cellule, ma rimane un processo laborioso e dispendioso in termini di tempo, che potrebbe non essere fattibile per tutti i progetti. Qui descriviamo l'uso di una piattaforma di analisi delle immagini, in grado di stimare con precisione la quantità di celle etichettate in una regione di interesse predefinita. Descriviamo un protocollo passo-passo per questo metodo di analisi nel cervello del ratto e dimostriamo che può identificare una significativa riduzione dei neuroni positivi tirosina idrossilasi a causa dell'espressione della α-sinuleina mutante nella substantia nigra. Abbiamo convalidato questa metodologia confrontando i risultati ottenuti da stereologia imparziale. Nel complesso, questo metodo fornisce un processo efficiente in termini di tempo e accurato per rilevare i cambiamenti nel numero di neuroni dopaminergici, ed è quindi adatto per una determinazione efficiente dell'effetto degli interventi sulla sopravvivenza cellulare.

Introduzione

Il morbo di Parkinson (PD) è un disturbo del movimento neurodegenerativo prevalente caratterizzato dalla presenza di aggregati proteici contenenti α-sinuleina (α-syn) e dalla perdita preferenziale di neuroni dopaminergici nella substantia nigra pars compacta (SNpc)¹. La quantificazione del numero di neuroni dopaminergici è una parte vitale della ricerca PD in quanto consente la valutazione dell'integrità del sistema nigrostriatale, fornendo così un endpoint importante per valutare l'efficacia delle potenziali terapie che modificano la malattia. Attualmente, lo standard per la quantificazione del numero di cellule è il conteggio stereologico imparziale, che utilizza sezioni trasversali bidimensionali (2D) del tessuto per stimare le caratteristiche volumetriche nelle strutture tridimensionali (3D)^2,3,4. I moderni metodi stereologici basati sulla progettazione utilizzano procedure di campionamento casuali complete e applicano protocolli di conteggio (noti come sonde) per evitare potenziali artefatti ed errori sistematici, consentendo un rilevamento affidabile delle differenze solo leggermente superiore alla variazione tra animali⁵. Mentre la stereologia fornisce un potente strumento analitico per studi istologici in vivo, richiede molto tempo, presuppone una preparazione uniforme del campione e richiede la convalida in diversi passaggi, il che può influire sull'efficienza sempre più richiesta per l'indagine traslazionale preclinale.

I recenti progressi tecnologici nella scienza digitale rendono possibile l'adozione di nuove applicazioni per valutazioni più efficienti della patologia senza stereomicroscopio, pur riempiendo un'esigenza di surrogato di stereologia imparziale. Questi metodi aumentano la velocità, riducono l'errore umano e migliorano la riproducibilità delle tecniche^{stereologiche 6,7}. HALO è una di queste piattaforme di analisi delle immagini per l'analisi quantitativa dei tessuti nella patologia digitale. Comprende una varietà di moduli diversi e riporta dati di espressione morfologici e multiplexati su base cellulare per cella su intere sezioni tissutali utilizzando algoritmi di riconoscimento dei modelli. Il modulo FL citonucleare misura la positività immunofluorescente dei marcatori fluorescenti nel nucleo o nel citoplasma. Ciò consente di segnalare il numero di celle positive per ogni marcatore e il punteggio di intensità per ogni cella. Il modulo può essere adattato per fornire le singole dimensioni cellulari e le misurazioni dell'intensità, anche se questa caratteristica non è necessaria per la quantificazione dei neuroni dopaminergici.

Lo scopo di questo studio è quello di verificare questo metodo con un modello di ratto α-syn basato su vettori virali precedentemente convalidato di neurodegenerazione nigrale^8,9,10. In questo modello, il mutante umano A53T α-syn è espresso nell'SNpc per iniezione stereotassitica del sierotipo ibrido virus adeno-associato 1/2 (AAV1/2), con conseguente significativa neurodegenerazione per un periodo di 6 settimane. L'SNpc non iniettato contralaterale può, in alcuni studi, servire da controllo interno per il lato iniettato. Più comunemente, l'iniezione di vettore vuoto AAV (AAV-EV) in una coorte di controllo degli animali viene utilizzata come controllo negativo. Presentiamo una guida dettagliata per stimare la densità dei neuroni dopaminergici che rimangono nell'SNpc iniettato dopo 6 settimane utilizzando un software automatizzato di analisi delle immagini(Figura 1).

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Protocollo

Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato per la cura degli animali della rete sanitaria universitaria ed eseguite in conformità con le linee guida e i regolamenti stabiliti dal Canadian Council on Animal Care.

1. Iniezione stereotassia

1. Coppia femmina adulta Ratti Sprague-Dawley (250-280 g) in gabbie con biancheria da letto in legno e accesso ad lib a cibo e acqua. Mantenere la colonia animale in un ciclo normale di luce/buio di 12 ore (luci accese alle 06:30) con temperatura e umidità costanti.
2. Eseguire l'iniezione stereotassiva unilaterale di AAV direttamente all'SNpc sul lato destro del cervello (lato destro o sinistro, secondo le preferenze di ogni laboratorio) come^{descritto in precedenza 8,10}. Iniettare 2 μL di AAV1/2 ad un formicolio finale di 3,4 x 10¹² particelle genomiche/mL.

2. Sezione cerebrale e immunoistochimica (IHC)

1. Anestetizzare il ratto con il 5% di isoflurane mettendolo in una camera anestetizzante per 3 min. Altri metodi approvati possono essere utilizzati per questo passaggio dopo un'adeguata revisione istituzionale.
2. Una volta che il ratto ha raggiunto un piano chirurgico di anestesia profonda, trasferirlo in un cono nasale saldamente apposto su un tavolo necroscopia. Fissare le zampe anteriori del topo usando il nastro adesivo e utilizzare il metodo di risposta delle dita dei piedi per determinare la profondità dell'anestesia. L'animale deve non rispondere prima di continuare.
3. Fare un'incisione laterale sotto lo sterno e tagliare attraverso il diaframma lungo l'intera lunghezza della gabbia toracica per esporre la cavità pleurica. Sollevare e bloccare lo sterno con un emostato e posizionarsi sopra la testa.
4. Bloccare il cuore utilizzando le pinze e inserire un ago a farfalla collegato a una pompa perfusione nell'estremità posteriore del ventricolo sinistro. Perfondere il ratto transcardialmente con 150 mL di soluzione salina eparinata o fino a quando gli occhi e la pelle non sono chiari. La perfusione con paraformaldeide al 4% (PFA), invece della soluzione salina, può essere preferita per facilitare l'immunosottenimento con determinati anticorpi o sessatura cerebrale più sottile.
5. Una volta completata la perfusione, decapitare con una ghigliottina ed estrarre il cervello in una matrice cerebrale, superficie ventrale rivolta verso l'alto.
6. Utilizzando una lama di rasoio fresca, fai un taglio nel piano coronale 2 mm rostrale al chiasmo ottico. Far scorrere la lama da un lato all'altro per evitare di dedire il cervello durante l'affettamento.
7. Immergere la porzione posteriore del cervello in una fiala pre-etichettata contenente circa 20 mL di PFA al 4% per 48 ore di post-fissazione a temperatura ambiente. La porzione anteriore del cervello può essere congelata in 2-metilbutano raffreddato a -42 °C prima della conservazione a -80 °C.
8. Dopo 48 ore, trasferire il cervello fisso su una fiala etichettata contenente il 30% di saccarosio in salina tamponata dal fosfato (PBS) e conservare a 4 °C fino ad affondare (48-72 h).
9. Preparare un microtomo posizionando ghiaccio secco nel trogolo dello stadio del campione, seguito da etanolo al 100%. Una volta raffreddato lo stadio, spremere il composto della temperatura di taglio ottimale (OCT) sullo stadio fino a 30 30 cm di diametro e 0,5 cm di spessore. Una volta parzialmente congelato, abbassare accuratamente il cervello sul tumulo di OCT, assicurando che la superficie di taglio striata rimanga parallela allo stadio.
10. Aggiungi più ghiaccio secco sul palco per aiutare il cervello a congelare. Una volta che il cervello ha trasformato un colore crema, sgombra lo stadio del ghiaccio secco.
11. Infilare un buco nel lato destro del cervello con un ago 25G per distinguere l'emisfero destro e sinistro. Fare attenzione a non passare l'ago attraverso strutture anatomiche di interesse.
12. Tagliare in serie sezioni da 40 μm nel piano coronale a partire da bregma -3,8 e terminando a bregma -6,8.
13. Conservare sei serie in tubi etichettati con soluzione antigelo (40% PBS, 30% 2-etossietanolo, 30% glicerolo). Ogni serie dovrebbe contenere 12 sezioni cerebrali.
14. Selezionare una serie di sezioni per la colorazione immunoistochimica e lavare via la soluzione antigelo con lavaggi 3 x 10 minuti nello 0,2% di PBS-T.
15. Blocco per 1 h a RT con nutazione delicata in soluzione di blocco (10% siero di capra normale (NGS), 2% albumina di siero bovino (BSA) nello 0,2% PBS-T). Seguire questo con incubazione con anticorpo anti-tirosina del coniglio (TH) anticorpo (1:500) e anticorpo anti-α-syn del topo (1:500) nel 2% NGS nello 0,2% PBS-T durante la notte a temperatura ambiente.
16. Lavare via l'anticorpo primario con lavaggi 3 x 5 minuti nello 0,2% di PBS-T, seguito da 1 h di incubazione con anticorpo secondario Alexa Fluor 488 (1:500) e anti-topo di capra Alexa Fluor 555 nell'anticorpo secondario 2% NGS nello 0,2% PBS-T. Assicurarsi che le sezioni siano protette dalla luce e dalla nutazione delicatamente.
17. Lavare l'anticorpo secondario con lavaggi da 3 x 5 minuti nello 0,2% di PBS-T e montare l'insieme completo di sezioni su diapositive protette da luce e polvere utilizzando un pennello stretto. Copriscivolo con mezzo di montaggio a fluorescenza e guarnizione con vernice chiara per unghie.

3. Microscopia confocale e acquisizione di immagini

1. Cattura le immagini IHC utilizzando un software accoppiato a un microscopio confocale con ingrandimento 10x. Apri il foro stenopeico a 1,5 UA per catturare un piano largo per un totale di ~ 1,5 μm e impostare l'attenzione sul lato iniettato del cervello.
2. Nella scheda Acquisizione selezionare l'opzione di imaging Scansione riquadro e impostare le dimensioni su 10 x 4.
3. Nel pannello Modalità acquisizione, impostate lo zoom su 1.1. Questo aiuta a evitare evidenti segni di cucitura tra le immagini di scansione dei riquadri.
4. Impostate la dimensione del fotogramma su 1024 x 1024 pixel e la media su 2 per garantire un'acquisizione di immagini di alta qualità.
5. Nel pannello Canali, traccia 1 su Alexa488 e traccia 2 per Alexa555.
6. Caricare la diapositiva sul palco e scegliere una sezione con una forte colorazione TH. Clicca su Live sul pannello Acquisizione.
7. Nel pannello Canali, impostate la forza e il guadagno laser su livelli che massimizzano il segnale e limitano il rumore dallo sfondo. Utilizzare l'indicatore di intervallo per assicurarsi che i segnali non siano sovraesposti (come indicato da una sovrapposizione rosso scuro).
8. Ripetere il passaggio precedente con più diapositive per assicurarsi che la colorazione sia coerente tra le diapositive in quanto la resistenza/guadagno del laser non può essere regolata tra le diapositive.
9. Nella scheda Acquisizione selezionare la casella Posizioni.
10. A questo punto, sei pronto per iniziare l'imaging. Utilizzando l'oculare, scegliete la prima sezione che mostra la colorazione TH positiva, impostate la messa a fuoco nel punto di interesse (cioè SNpc) e quindi spostate lo stadio sulla linea mediana della sezione. In questo modo viene salvata la posizione negli assi x, y e z e verrà etata una scansione del riquadro che cattura l'intera sezione.
11. Ripetere il passaggio precedente per tutte le sezioni dell'SNpc fornendo un set completo di immagini dell'SNpc. Se è necessaria un'analisi dettagliata del lato non iniettato, i passaggi da 3.10 a 3.11 devono essere ripetuti impostando l'attenzione sul lato non iniettato.

4. Analisi e quantificazione delle immagini

1. Separare i file di immagine utilizzando il software appropriato e importare file di immagine in un software di analisi automatica delle immagini.
2. Definite un'area di interesse selezionando lo strumento di annotazione Penna per disegnare un'annotazione attorno all'SNpc.
   NOTA: Nelle sezioni che hanno una grande quantità di perdita di neuroni dopaminergici, aumentare temporaneamente l'emettitore / assorbimento può aiutare a definire chiaramente l'SNpc (Figura 2).
3. Passare alla scheda Analisi e scegliere Ottimizzazione in tempo reale dal menu a discesa Analizza. In questo modo viene aperta una finestra separata sull'immagine della sezione che consente la modifica in tempo reale dei parametri di analisi (Figura 3).
4. Nella sezione Ingrandimento analisi selezionare lo zoom dell'immagine appropriato.
5. Nella sezione Rilevamento celle, selezionare il colorante nucleare come colorante utilizzato per la colorazione TH (Alexa Fluor 488).
6. Regolare le impostazioni Soglia di contrasto nucleare, Intensità nucleare minima, Aggressività di segmentazionenucleare e Dimensioni nucleari, osservando attentamente la finestra Sintonizzazione in tempo reale.
   NOTA: una rappresentazione accurata di ogni singola cella come singola cella nella finestra Sintonizzazione in tempo reale è vitale per l'accuratezza. Queste impostazioni sono su scala arbitraria a seconda del software utilizzato, ma è necessaria una corretta regolazione per consentire al software di distinguere accuratamente tra le singole celle e tra le celle e lo sfondo (Figura 3).
7. Ripetere questo processo con un minimo di 10 campioni separati per garantire un accordo uniforme su ciò che costituisce una cella in diverse sezioni.
   NOTA: ulteriori marcatori di cella (come α-syn o NeuN) possono essere identificati all'interno della stessa piattaforma di analisi utilizzando le sezioni Marcatore 1 o Marcatore 2 nella scheda analisi.
8. Dopo aver campionato un numero appropriato di immagini e aver regolato di conseguenza l'ottimizzazione in tempo reale, salvare le impostazioni di analisi nel menu a discesa Azioni impostazioni.
9. Selezionare tutte le immagini da analizzare e fare clic su Analizza.
10. Scegliete l'impostazione di analisi appena salvata e nella finestra Regione di analisi selezionare la casella Livelli di annotazione. Quindi, selezionare Livello 1 e fare clic su Analizza.
    NOTA: Per un singolo cervello, l'analisi richiede in genere circa 5 minuti. Il risultato completato mostrerà chiaramente ogni elemento che è stato conteggiato come cella (Figura 4).
11. Una volta completato, esportare i dati di analisi di riepilogo per tutte le sezioni. È disponibile un'opzione per esportare Object Analysis Data, che fornirà dati dettagliati, incluse le dimensioni delle celle di ogni singola cella rilevata. Questo set di dati potrebbe essere utilizzato per esaminare i cambiamenti nelle dimensioni delle cellule in risposta a una tossina /terapeutica.
12. Aggiungere le celle totali di ogni sezione analizzata per animale e l'area totale analizzata (mm²). Dividere il numero totale di celle per l'area totale analizzata per calcolare il numero di celle/mm² nell'SNpc per ogni ratto

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Risultati

Applicando i metodi di cui sopra al tessuto cerebrale raccolti 6 settimane dopo le iniezioni di AAV, abbiamo dimostrato che l'iniezione stereotassica di AAV che esprime mutante A53T α-syn (AAV-A53T) nell'SNpc del cervello del ratto si traduce in una significativa riduzione della densità dei neuroni dopaminergici rispetto all'iniezione di vettore vuoto AAV (AAV-EV) come controllo(Figura 5A, B). Il numero medio di neuroni TH-positivi/mm² nell'SNpc dei ratti iniett...

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Discussione

La valutazione affidabile dell'integrità del sistema dopaminergico nei modelli preclinali di PD è fondamentale per determinare l'efficacia delle potenziali terapie che modificano la malattia. Pertanto, è importante controllare e ridurre al minimo le potenziali confusioni che possono ridurre l'affidabilità e la riproducibilità dei dati istopatologici. Risultati quantitativi accurati possono fornire più informazioni rispetto alle sole descrizioni qualitative o semi-quantitative. Allo stesso tempo, dobbiamo riconoscer...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
A-Syn Antibody	ThermoFisher Scientific	32-8100
ABC Elite	Vector Labs	PK-6102
Alexa Fluor 488 secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-11008
Alexa Fluor 555 secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-28180
Alkaline phosphatase-conjugated anti-rabbit igG	Jackson Immuno	111-055-144
Biotinylated anti-mouse IgG	Vector Labs	BA-9200
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153
DAKO fluorescent mouting medium	Agilent	S3023
HALO™	Indica Labs
Histo-Clear II	Diamed	HS202
ImmPACT DAB Peroxidase substrate	Vector Labs	SK-4105
LSM880 Confocal Microscope	Zeiss
NeuN Antibody	Millipore	MAB377
Normal Goat Serum	Vector Labs	S-1000-20
OCT	Tissue-Tek
Paraformaldehyde	BioShop	PAR070.1
Sliding microtome	Leica	SM2010 R
Stereo Investigator	MBF Bioscience
Sucrose	BioShop	SUC700
TH Antibody	ThermoFisher Scientific	P21962
VectaMount mounting medium	Vector Labs	H-5000
Vector Blue Alkaline Phosphatase substrate	Vector Labs	SK-5300
Zen Black Software	Zeiss
Zen Blue Software	Zeiss