Полу количественное определение плотности дофаминергических нейронов в Чернии субстанции моделей грызунов с использованием автоматизированного анализа изображений

Резюме

Здесь представлен автоматизированный метод полу количественного определения числа дофаминергических нейронов в крысиной субстанции nigra pars compacta.

Аннотация

Оценка количества дофаминергических нейронов в чернии субстанции является ключевым методом в доклинических исследованиях болезни Паркинсона. В настоящее время непредвзятый стереологический подсчет является стандартом для количественной оценки этих клеток, но он остается трудоемким и трудоемким процессом, который может быть неосуществим для всех проектов. Здесь мы описываем использование платформы анализа изображений, которая может точно оценить количество меченых клеток в заранее определенной области интереса. Мы описываем пошаговый протокол для этого метода анализа в мозге крыс и демонстрируем, что он может идентифицировать значительное снижение положительных нейронов тирозингидроксилазы из-за экспрессии мутантного α-синуклеина в черную субстанцию. Мы проверили эту методологию, сравнив с результатами, полученными с помощью непредвзятой стереологии. Взятый вместе, этот метод обеспечивает эффективный по времени и точный процесс обнаружения изменений в количестве дофаминергических нейронов и, таким образом, подходит для эффективного определения влияния вмешательств на выживание клеток.

Введение

Болезнь Паркинсона (БП) является распространенным нейродегенеративным расстройством движения, характеризующимся наличием белковых агрегатов, содержащих α-синуклеин (α-син) и предпочтительной потерей дофаминергических нейронов в субстанции nigra pars compacta (SNpc)^1. Количественная оценка числа дофаминергических нейронов является жизненно важной частью исследования БП, поскольку она позволяет оценить целостность нигростриатальной системы, обеспечивая тем самым важную конечную точку для оценки эффективности потенциальных модифицирующих заболевание терапевтических средств. В настоящее время стандартом количественной оценки числа клеток является непредвзятый стереологический подсчет, который использует двумерные (2D) поперечные сечения ткани для оценки объемных особенностей в трехмерных (3D) структурах^2,3,4. Современные стереологические методы, основанные на проектировании, используют комплексные процедуры случайной выборки и применяют протоколы подсчета (известные как зонды), чтобы избежать потенциальных артефактов и систематических ошибок, что позволяет надежно обнаруживать различия, лишь немного большие, чем вариации между животными^5. Хотя стереология обеспечивает мощный аналитический инструмент для гистологических исследований in vivo, она занимает много времени, предполагает равномерную подготовку образца и требует валидации на нескольких этапах, что может повлиять на эффективность, все более необходимую для доклинического трансляционного исследования.

Последние технологические достижения в цифровой науке позволяют принимать новые приложения для более эффективной оценки патологии без стереомикроскопа, одновременно удовлетворяя потребность в качестве суррогата непредвзятой стереологии. Эти методы увеличивают скорость, уменьшают человеческую ошибку и улучшают воспроизводимость стереологических методов^6,7. HALO является одной из таких платформ анализа изображений для количественного анализа тканей в цифровой патологии. Он включает в себя множество различных модулей и сообщает морфологические и мультиплексированные данные экспрессии на клеточной основе по целым участкам ткани с использованием алгоритмов распознавания образов. Модуль cytonuclear FL измеряет иммунофлуоресцентную позитивность флуоресцентных маркеров в ядре или цитоплазме. Это позволяет сообщать о количестве клеток, положительных для каждого маркера, и оценке интенсивности для каждой ячейки. Модуль может быть адаптирован для обеспечения индивидуальных размеров клеток и измерений интенсивности, хотя эта функция не требуется для количественной оценки дофаминергических нейронов.

Целью данного исследования является проверка этого метода с помощью ранее проверенной вирусной векторной модели α-син крыс нигральной нейродегенерации^8,9,10. В этой модели человеческий мутант A53T α-syn экспрессируется в SNpc путем стереотаксической инъекции аденоассоциированного вируса гибридного серотипа 1/2 (AAV1/2), что приводит к значительной нейродегенерации в течение 6 недель. Контралатеральный неинъекционный SNpc может, в некоторых исследованиях, служить внутренним контролем для вводимой стороны. Чаще всего инъекция AAV-пустого вектора (AAV-EV) в контрольную когорту животных используется в качестве отрицательного контроля. Мы представляем пошаговое руководство по оценке плотности дофаминергических нейронов, оставшихся в введенном SNpc через 6 недель с использованием автоматизированного программного обеспечения для анализа изображений(рисунок 1).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все процедуры были одобрены Комитетом по уходу за животными Университетской сети здравоохранения и выполнены в соответствии с руководящими принципами и правилами, установленными Канадским советом по уходу за животными.

1. Стереотаксическая инъекция

1. Парная взрослая самка крыс Sprague-Dawley (250-280 г) в клетках с древесной подстилкой и доступом к пище и воде. Поддерживайте колонию животных в регулярном 12-часовом цикле света / темноты (свет на 06:30) с постоянной температурой и влажностью.
2. Выполняют одностороннюю стереотаксическую инъекцию AAV непосредственно в SNpc на правой стороне мозга (правой или левой стороне, согласно предпочтениям каждой лаборатории), как описано^{ранее 8,10.} Вводят 2 мкл AAV1/2 при конечном титре 3,4 х 10¹² геномных частиц/мл.

2. Сечение мозга и иммуногистохимия (IHC)

1. Обезболивают крыс 5% изофлураном, помещая в обезболивающую камеру на 3 мин. Другие утвержденные методы могут быть использованы для этого этапа после соответствующего институционального обзора.
2. Как только крыса достигнет хирургической плоскости глубокой анестезии, перенесите ее на носовой конус, прочно прикрепленный к столу для некропсии. Закрепите перепалки крысы с помощью ленты и используйте метод щипа-ответа на щипания, чтобы определить глубину анестезии. Животное должно не реагировать, прежде чем продолжить.
3. Сделайте боковой разрез ниже грудины и прорежьте диафрагму по всей длине грудной клетки, чтобы обнажить плевральную полость. Поднимите и зажмите грудину гемостатом и поместите над головой.
4. Зажмите сердце с помощью щипцов и вставьте иглу бабочки, соединенную с перфузионной накачкой, в задний конец левого желудочка. Перфьюируют крысу транскардиально 150 мл гепаринизированного физиологического раствора или до тех пор, пока глаза и кожа не будут чистыми. Перфузия с 4% параформальдегидом (PFA), вместо физиологического раствора, может быть предпочтительной для облегчения иммуноокрашивания определенными антителами или более тонкого сечения мозга.
5. Как только перфузия будет завершена, обезглавить с помощью гильотины и извлечь мозг в мозговой матрикс, вентральную поверхность, обращенную вверх.
6. Используя свежее лезвие бритвы, сделайте разрез в корональной плоскости 2 мм ростраля к зрительной хиазме. Скользите лезвием из стороны в сторону, чтобы избежать деформации мозга во время нарезки.
7. Погрузите заднюю часть мозга в предварительно меченый флакон, содержащий примерно 20 мл 4% PFA в течение 48 ч постфиксации при комнатной температуре. Передняя часть мозга может быть заморожена в 2-метилбутане, охлажденным до -42 °C перед хранением при -80 °C.
8. Через 48 ч переложите неподвижный мозг в меченый флакон, содержащий 30% сахарозы в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS), и храните при 4 °C до тех пор, пока они не утонут (48-72 ч).
9. Подготовьте микротом, поместив сухой лед в желоб стадии образца, а затем 100% этанол. После того, как сцена остынет, выдавите на сцену компаунд оптимальной температуры резки (OCT), пока он не образует круг диаметром 2 см и толщиной 0,5 см. Как только он частично замерзнет, осторожно опустите мозг на насыпь OCT, гарантируя, что поверхность режущей стриатальной области остается параллельной стадии.
10. Добавьте больше сухого льда на сцену, чтобы помочь мозгу замерзнуть. Как только мозг окрасится в кремовый цвет, очистите стадию от сухого льда.
11. Проделайте отверстие в правой части мозга иглой 25G, чтобы различать правое и левое полушария. Следите за тем, чтобы не пропустить иглу через анатомические структуры, представляющие интерес.
12. Последовательно разрезанные 40 мкм участки в корональной плоскости, начинающиеся при брегме -3,8 и заканчивающиеся на брегме -6,8.
13. Хранить шесть серий в меченых тубах с антифризным раствором (40% PBS, 30% 2-этоксиэтанол, 30% глицерин). Каждая серия должна содержать 12 секций мозга.
14. Выберите один набор секций для иммуногистохимического окрашивания и смойте антифризный раствор 3 х 10 мин промывками в 0,2% PBS-T.
15. Блокируют в течение 1 ч при РТ с щадящим нутированием в блокирующем растворе (10% нормальная козья сыворотка (NGS), 2% бычоковый сывороточный альбумин (BSA) в 0,2% PBS-T). Затем следует инкубация с антителом против тирозингидроксилазы кролика (TH) (1:500) и антителом против α-син у мыши (1:500) в 2% NGS в 0,2% PBS-T в течение ночи при комнатной температуре.
16. Смывайте первичное антитело 3 х 5 мин промывками в 0,2% PBS-T, затем 1 ч инкубации с козьим анти-кроликом Alexa Fluor 488 вторичным антителом (1:500) и козьим антимышиным Alexa Fluor 555 вторичным антителом в 2% NGS в 0,2% PBS-T. Убедитесь, что секции защищены от света и мягкой нутации.
17. Смойте вторичные антитела 3 х 5 мин промывками в 0,2% PBS-T и установите полный набор секций на слайды, защищенные от света и пыли, с помощью узкой кисти. Обшивка с флуоресцентной монтажной средой и уплотнением прозрачным лаком для ногтей.

3. Конфокальная микроскопия и получение изображений

1. Захват изображений IHC с помощью программного обеспечения, подключенного к конфокальному микроскопу с 10-кратным увеличением. Откройте точечное отверстие до 1,5 а.е., чтобы захватить широкую плоскость общей суммой ~ 1,5 мкм и установить фокус на введенной стороне мозга.
2. На вкладке Приобретение установите флажок Изображение сканирования плитки и установите размеры 10 x 4.
3. На панели «Режим получения» установите для кнопки «Масштаб» значение 1,1. Это помогает избежать каких-либо очевидных следов сшивания между изображениями сканирования плиток.
4. Установите размер кадра 1024 x 1024 пикселя, а значение Усреднение — 2, чтобы обеспечить высокое качество получения изображения.
5. На панели «Каналы» задайте для трека 1 значение Alexa488 и для трека 2 — Alexa555.
6. Загрузите слайд на сцену и выберите участок с сильным окрашиванием TH. Нажмите «В реальном времени» на панели «Приобретение».
7. На панели «Каналы» установите для параметров «Сила и усиление лазера» уровни, которые максимизируют сигнал и ограничивают шум от фона. Используйте индикатор диапазона, чтобы убедиться, что сигналы не переэкспонированы (как указано в темно-красном наложении).
8. Повторите приведенный выше шаг с несколькими слайдами, чтобы убедиться, что окрашивание происходит между слайдами, так как сила / усиление лазера не может быть отрегулировано между слайдами.
9. На вкладке Приобретение установите флажок Позиции.
10. На этом этапе вы готовы приступить к визуализации. Используя окуляр, выберите первую секцию, показывающую положительное окрашивание TH, установите фокус в интересующей точке (т. Е. SNpc), а затем переместите сцену в среднюю линию секции. Это сохранит положение в осях x, y и z и создаст изображение сканирования плитки, захватывая весь раздел.
11. Повторите приведенный выше шаг для всех разделов SNpc, предоставляя полный набор изображений SNpc. Если требуется подробный анализ неинъекированной стороны, шаги 3.10-3.11 следует повторить, установив фокус на неинжекторную сторону.

4. Анализ и количественное оценка изображений

1. Разделяйте файлы изображений с помощью соответствующего программного обеспечения и импортируйте файлы изображений в автоматизированное программное обеспечение для анализа изображений.
2. Определите интересующую область, выбрав инструмент «Заметка пером», чтобы нарисовать аннотацию вокруг SNpc.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В участках, которые имеют большое количество потерь дофаминергических нейронов, временное увеличение эмиттанса/абсорбции может помочь четко определить SNpc(рисунок 2).
3. Перейдите на вкладку Анализ и в раскрывающемся меню Анализ выберите Настройка в реальном времени. Откроется отдельное окно на изображении раздела, позволяющее в режиме реального времени изменять параметры анализа(рисунок 3).
4. В разделе Увеличение анализа выберите соответствующий масштаб изображения.
5. В разделе «Обнаружение клеток» выберите ядерный краситель в качестве красителя, используемого для окрашивания TH (Alexa Fluor 488).
6. Отрегулируйте настройки «Порог ядерной контрастности», «Минимальная ядерная интенсивность», «Агрессивность ядерной сегментации»и «Ядерный размер», внимательно следя за окном настройки в режиме реального времени.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Точное представление каждой отдельной ячейки как одной ячейки в окне настройки в реальном времени имеет жизненно важное значение для точности. Эти настройки находятся в произвольном масштабе в зависимости от используемого программного обеспечения, но необходима правильная настройка, чтобы позволить программному обеспечению точно различать отдельные ячейки, а также между ячейками и фоном(рисунок 3).
7. Повторите этот процесс с минимум 10 отдельными образцами, чтобы обеспечить единообразное согласование того, что представляет собой ячейка в разных секциях.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительные маркеры ячеек (такие как α-syn или NeuN) могут быть идентифицированы в рамках той же аналитической платформы с помощью разделов Маркер 1 или Маркер 2 на вкладке анализа.
8. После выборки соответствующего количества изображений и соответствующей настройки в режиме реального времени сохраните параметры анализа в раскрывающемся меню Действия параметров.
9. Выберите все изображения для анализа и нажмите «Анализировать».
10. Выберите параметр анализа, который вы только что сохранили, и в окне Область анализа установите флажок Слои аннотаций. Затем проверьте уровень 1 и нажмите «Анализировать».
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для одного мозга анализ обычно занимает около 5 минут. Завершенный результат будет четко показывать каждый элемент, который был засчитан как ячейка(рисунок 4).
11. После завершения экспортируйте сводные данные анализа для всех разделов. Существует возможность экспорта данных анализа объектов,которые дадут подробные данные, включая размер ячейки каждой обнаруженной отдельной ячейки. Этот набор данных может быть использован для изучения изменений размера клеток в ответ на токсин / терапевтическое средство.
12. Добавьте общее количество клеток из каждого раздела, проанализированного на животное, и общую анализируемую площадь (мм^2). Разделите общее количество клеток на общую площадь, проанализированную для расчета количества клеток/мм2 в SNpc для каждой крысы

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Применяя вышеуказанные методы к ткани мозга, собранной через 6 недель после инъекций AAV, мы продемонстрировали, что стереотаксическая инъекция AAV, экспрессирующую мутант A53T α-syn (AAV-A53T) в SNpc мозга крысы, приводит к значительному снижению плотности дофаминергических нейронов по сравнению ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Достоверная оценка целостности дофаминергической системы в доклинических моделях БП имеет решающее значение для определения эффективности потенциальных модифицирующих заболевание терапевтических средств. Поэтому важно контролировать и минимизировать потенциальные путаницы, кот?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
A-Syn Antibody	ThermoFisher Scientific	32-8100
ABC Elite	Vector Labs	PK-6102
Alexa Fluor 488 secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-11008
Alexa Fluor 555 secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-28180
Alkaline phosphatase-conjugated anti-rabbit igG	Jackson Immuno	111-055-144
Biotinylated anti-mouse IgG	Vector Labs	BA-9200
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153
DAKO fluorescent mouting medium	Agilent	S3023
HALO™	Indica Labs
Histo-Clear II	Diamed	HS202
ImmPACT DAB Peroxidase substrate	Vector Labs	SK-4105
LSM880 Confocal Microscope	Zeiss
NeuN Antibody	Millipore	MAB377
Normal Goat Serum	Vector Labs	S-1000-20
OCT	Tissue-Tek
Paraformaldehyde	BioShop	PAR070.1
Sliding microtome	Leica	SM2010 R
Stereo Investigator	MBF Bioscience
Sucrose	BioShop	SUC700
TH Antibody	ThermoFisher Scientific	P21962
VectaMount mounting medium	Vector Labs	H-5000
Vector Blue Alkaline Phosphatase substrate	Vector Labs	SK-5300
Zen Black Software	Zeiss
Zen Blue Software	Zeiss