Semi-quantitative Bestimmung der dopaminergen Neuronendichte in der Substantia Nigra von Nagetiermodellen mittels automatisierter Bildanalyse

Zusammenfassung

Hier stellen wir eine automatisierte Methode zur semi-quantitativen Bestimmung der dopaminergen Neuronenzahl in der Rattensubantia nigra pars compacta vor.

Zusammenfassung

Die Abschätzung der Anzahl dopaminerger Neuronen in der Substantia nigra ist eine Schlüsselmethode in der präklinischen Parkinson-Forschung. Derzeit ist die unvoreingenommene stereologische Zählung der Standard für die Quantifizierung dieser Zellen, aber es bleibt ein mühsamer und zeitaufwendiger Prozess, der möglicherweise nicht für alle Projekte durchführbar ist. Hier beschreiben wir den Einsatz einer Bildanalyseplattform, die die Menge der markierten Zellen in einem vordefinierten Interessenbereich genau abschätzen kann. Wir beschreiben ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für diese Analysemethode im Rattengehirn und zeigen, dass es eine signifikante Reduktion der Tyrosinhydroxylase-positiven Neuronen aufgrund der Expression von mutiertem α-Synuclein in der Substantia nigra identifizieren kann. Wir validierten diese Methodik durch Vergleich mit Ergebnissen, die durch unvoreingenommene Stereologie erzielt wurden. Zusammengenommen bietet diese Methode einen zeiteffizienten und genauen Prozess zur Erkennung von Veränderungen der dopaminergen Neuronenzahl und eignet sich somit für die effiziente Bestimmung der Wirkung von Interventionen auf das Zellüberleben.

Einleitung

Die Parkinson-Krankheit (PD) ist eine weit verbreitete neurodegenerative Bewegungsstörung, die durch das Vorhandensein von Proteinaggregaten gekennzeichnet ist, die α-Synuclein (α-syn) enthalten, und den bevorzugten Verlust dopaminerger Neuronen in der Substantia nigra pars compacta (SNpc)¹. Die Quantifizierung der dopaminergen Neuronenzahl ist ein wesentlicher Bestandteil der PD-Forschung, da sie die Bewertung der Integrität des nigrostriatalen Systems ermöglicht und somit einen wichtigen Endpunkt zur Beurteilung der Wirksamkeit potenzieller krankheitsmodifizierender Therapeutika darstellt. Derzeit ist der Standard für die Quantifizierung der Zellzahl die unvoreingenommene stereologische Zählung, die zweidimensionale (2D) Querschnitte von Gewebe verwendet, um volumetrische Merkmale in dreidimensionalen (3D) Strukturen^{abzuschätzen 2,3,4}. Moderne designbasierte stereologische Methoden verwenden umfassende Stichprobenverfahren und wenden Zählprotokolle (sogenannte Sonden) an, um potenzielle Artefakte und systematische Fehler zu vermeiden, so dass Unterschiede, die nur geringfügig größer sind als die Variation zwischen den Tieren, zuverlässig erkannt werden^{können 5.} Während die Sterologie ein leistungsfähiges Analysewerkzeug für histologische In-vivo-Studien darstellt, ist sie zeitintensiv, setzt eine einheitliche Probenvorbereitung voraus und erfordert eine Validierung in mehreren Schritten, was sich auf die Effizienz auswirken kann, die zunehmend für präklinische translationale Untersuchungen erforderlich ist.

Jüngste technologische Fortschritte in der digitalen Wissenschaft ermöglichen es, neuartige Anwendungen für effizientere Beurteilungen der Pathologie ohne Stereomikroskop zu übernehmen und gleichzeitig den Bedarf als Ersatz für unvoreingenommene Stereologie zu decken. Diese Methoden erhöhen die Geschwindigkeit, reduzieren menschliche Fehler und verbessern die Reproduzierbarkeit stereologischer Techniken^6,7. HALO ist eine solche Bildanalyseplattform für die quantitative Gewebeanalyse in der digitalen Pathologie. Es besteht aus einer Vielzahl verschiedener Module und berichtet morphologische und multiplexte Expressionsdaten auf Zell-für-Zell-Basis über ganze Gewebeschnitte mit Hilfe von Mustererkennungsalgorithmen. Das zytonukleäre FL-Modul misst die immunfluoreszierende Positivität von fluoreszierenden Markern im Zellkern oder Zytoplasma. Dies ermöglicht die Meldung der Anzahl der positiven Zellen für jeden Marker und des Intensitätswerts für jede Zelle. Das Modul kann angepasst werden, um individuelle Zellgrößen und Intensitätsmessungen bereitzustellen, obwohl diese Funktion für die Quantifizierung dopaminerger Neuronen nicht erforderlich ist.

Ziel dieser Studie ist es, diese Methode mit einem zuvor validierten viralen Vektor-basierten α-Syn-Rattenmodell der nigralen Neurodegeneration^8,9,10zu verifizieren. In diesem Modell wird die humane Mutante A53T α-syn im SNpc durch stereotaktische Injektion von Adeno-assoziiertem Virus-Hybrid-Serotyp 1/2 (AAV1/2) exprimiert, was zu einer signifikanten Neurodegeneration über einen Zeitraum von 6 Wochen führt. Das kontralaterale unausgestoßene SNpc kann in einigen Studien als interne Kontrolle für die injizierte Seite dienen. Häufiger wird die Injektion von AAV-Empty Vector (AAV-EV) in eine Kontrollkohorte von Tieren als Negativkontrolle verwendet. Wir präsentieren eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Abschätzung der Dichte dopaminerger Neuronen, die nach 6 Wochen im injizierten SNpc verbleiben, mit einer automatisierten Bildanalysesoftware (Abbildung 1).

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Protokoll

Alle Verfahren wurden vom Animal Care Committee des University Health Network genehmigt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften des Canadian Council on Animal Care durchgeführt.

1. Stereotaktische Injektion

1. Paarhaus erwachsene weibliche Sprague-Dawley-Ratten (250-280 g) in Käfigen mit Holzeinstreu und ad lib Zugang zu Nahrung und Wasser. Halten Sie die Tierkolonie in einem regelmäßigen 12-Stunden-Hell-Dunkel-Zyklus (Lichter an 06:30 Uhr) mit konstanter Temperatur und Luftfeuchtigkeit.
2. Führen Sie eine einseitige stereotaktische Injektion von AAV direkt in den SNpc auf der rechten Seite des Gehirns (rechte oder linke Seite, je nach den Präferenzen jedes Labors) durch, wie zuvor beschrieben^8,10. Injizieren Sie 2 μL AAV1/2 bei einem Endtiter von 3,4 x 10¹² genomischen Partikeln/ml.

2. Hirnschnitt und Immunhistochemie (IHC)

1. Betäuben Sie die Ratte mit 5% Isofluran, indem Sie sie für 3 min in eine Betäubungskammer legen. Andere genehmigte Methoden können für diesen Schritt nach entsprechender institutioneller Überprüfung verwendet werden.
2. Sobald die Ratte eine chirurgische Ebene der tiefen Anästhesie erreicht hat, übertragen Sie sie auf einen Nasenkegel, der fest an einem Nekropsietisch befestigt ist. Sichern Sie die Vorpfoten der Ratte mit Klebeband und verwenden Sie die Zehenquetschreaktionsmethode, um die Tiefe der Anästhesie zu bestimmen. Das Tier muss nicht reagieren, bevor es weiterfährt.
3. Machen Sie einen seitlichen Schnitt unterhalb des Brustbeins und schneiden Sie das Zwerchfell entlang der gesamten Länge des Brustkorbs, um die Pleurahöhle freizulegen. Heben und klemmen Sie das Brustbein mit einem Hämostat und legen Sie es über den Kopf.
4. Klemmen Sie das Herz mit einer Zange und führen Sie eine Schmetterlingsnadel ein, die mit einer Perfusionspumpe verbunden ist, in das hintere Ende des linken Ventrikels. Perfusion ratte transkardial mit 150 ml heparinisierter Kochsalzlösung oder bis die Augen und die Haut klar sind. Perfusion mit 4% Paraformaldehyd (PFA) anstelle von Kochsalzlösung kann bevorzugt werden, um die Immunfärbung mit bestimmten Antikörpern oder eine dünnere Hirnschnitte zu erleichtern.
5. Sobald die Perfusion abgeschlossen ist, enthaupten Sie mit einer Guillotine und extrahieren Sie das Gehirn zu einer Gehirnmatrix, die ventrale Oberfläche nach oben zeigt.
6. Schneiden Sie mit einer frischen Rasierklinge in der koronalen Ebene 2 mm rostral zum optischen Chiasmus. Schieben Sie die Klinge von einer Seite zur anderen, um zu vermeiden, dass sich das Gehirn beim Schneiden verzog.
7. Tauchen Sie den hinteren Teil des Gehirns in eine vormarkierte Durchstechflasche mit etwa 20 ml 4% PFA für 48 Stunden Postfixierung bei Raumtemperatur. Der vordere Teil des Gehirns kann in 2-Methylbutan, gekühlt auf -42 °C, vor der Lagerung bei -80 °C flashgefroren werden.
8. Nach 48 h werden die fixierten Gehirne in eine markierte Durchstechflasche mit 30% Saccharose in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) überführt und bei 4 °C gelagert, bis sie sinken (48-72 h).
9. Bereiten Sie ein Mikrotom vor, indem Sie Trockeneis in den Trog der Probenstufe legen, gefolgt von 100% Ethanol. Sobald die Bühne abgekühlt ist, drücken Sie die Verbindung mit der optimalen Schnitttemperatur (OCT) auf die Bühne, bis sie einen Kreis von 2 cm Durchmesser und 0,5 cm Dicke bildet. Sobald es teilweise eingefroren ist, senken Sie das Gehirn vorsichtig auf den Hügel des OCT, um sicherzustellen, dass die striatale Schnittfläche parallel zur Stufe bleibt.
10. Fügen Sie der Bühne mehr Trockeneis hinzu, um dem Gehirn zu helfen, einzufrieren. Sobald das Gehirn eine Cremefarbe verfärbt hat, klären Sie das Stadium des Trockeneis.
11. Stechen Sie mit einer 25G-Nadel ein Loch in die rechte Seite des Gehirns, um die rechte und linke Hemisphäre zu unterscheiden. Achten Sie darauf, die Nadel nicht durch anatomische Strukturen von Interesse zu führen.
12. Schneiden Sie seriell 40 μm-Abschnitte in der koronalen Ebene, beginnend bei Bregma -3,8 und endend bei Bregma -6,8.
13. Lagern Sie sechs Serien in markierten Röhrchen mit Frostschutzlösung (40% PBS, 30% 2-Ethoxyethanol, 30% Glycerin). Jede Serie sollte 12 Gehirnabschnitte enthalten.
14. Wählen Sie einen Satz Abschnitte für die immunhistochemische Färbung und waschen Sie die Frostschutzlösung mit 3 x 10 min Waschgang in 0,2% PBS-T ab.
15. Block für 1 h bei RT mit sanfter Nutation in Blocklösung (10% normales Ziegenserum (NGS), 2% Rinderserumalbumin (BSA) in 0,2% PBS-T). Anschließend erfolgt die Inkubation mit Kaninchen-Antityrosinhydroxylase (TH)-Antikörper (1:500) und Maus-Anti-α-Syn-Antikörper (1:500) in 2% NGS in 0,2% PBS-T über Nacht bei Raumtemperatur.
16. Primärantikörper mit 3 x 5 min Waschungen in 0,2% PBS-T abwaschen, gefolgt von 1 h Inkubation mit Ziegen-Anti-Kaninchen Alexa Fluor 488 sekundären Antikörper (1:500) und Ziegen-Anti-Maus Alexa Fluor 555 sekundären Antikörper in 2% NGS in 0,2% PBS-T. Stellen Sie sicher, dass die Abschnitte vor Licht und Sanftnähren geschützt sind.
17. Sekundärantikörper mit 3 x 5 min Waschgang in 0,2% PBS-T abwaschen und den kompletten Satz Abschnitte mit einem schmalen Pinsel vor Licht und Staub geschützten Objektträgern montieren. Abdecklip mit Fluoreszenz-Montagemedium und Dichtung mit klarem Nagellack.

3. Konfokale Mikroskopie und Bildaufnahme

1. Erfassen Sie IHC-Bilder mit einer Software, die mit einem konfokalen Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung gekoppelt ist. Öffnen Sie das Loch auf 1,5 AE, um eine breite Ebene von insgesamt ~ 1,5 μm zu erfassen, und legen Sie den Fokus auf die injizierte Seite des Gehirns.
2. Aktivieren Sie auf der Registerkarte Erfassung die Option Kachelscan-Imaging, und legen Sie die Abmessungen auf 10 x 4 fest.
3. Legen Sie im Bedienfeld "Aufnahmemodus" den Zoom auf 1.1 fest. Dies hilft, offensichtliche Stichmarken zwischen Kachelscanbildern zu vermeiden.
4. Stellen Sie die Rahmengröße auf 1024 x 1024 Pixel und die Mittelwertbildung auf 2 ein, um eine qualitativ hochwertige Bildaufnahme zu gewährleisten.
5. Legen Sie im Bedienfeld "Kanäle" Track 1 auf Alexa488 und Track 2 auf "Alexa555" fest.
6. Laden Sie den Dia auf die Bühne und wählen Sie einen Abschnitt mit starker TH-Färbung. Klicken Sie im Bedienfeld "Akquisition" auf "Live".
7. Stellen Sie im Bedienfeld "Kanäle" die Laserstärke und -verstärkung auf Werte ein, die das Signal maximieren und das Rauschen aus dem Hintergrund begrenzen. Verwenden Sie die Bereichsanzeige, um sicherzustellen, dass die Signale nicht überbelichtet werden (wie durch eine dunkelrote Überlagerung angezeigt).
8. Wiederholen Sie den obigen Schritt mit mehreren Schlitten, um sicherzustellen, dass die Färbung zwischen den Schlitten konsistent ist, da die Laserstärke / -verstärkung zwischen den Objektträgern nicht angepasst werden kann.
9. Aktivieren Sie auf der Registerkarte Erfassung das Kontrollkästchen Positionen.
10. An diesem Punkt können Sie mit der Bildgebung beginnen. Wählen Sie mit dem Okular den ersten Abschnitt mit positiver TH-Färbung aus, setzen Sie den Fokus auf den Point of Interest (z. B. SNpc) und bewegen Sie dann die Bühne in die Mittellinie des Abschnitts. Dadurch wird die Position in den x-, y- und z-Achsen gespeichert und ein Kachelscan abgebildet, der den gesamten Abschnitt erfasst.
11. Wiederholen Sie den obigen Schritt für alle Abschnitte im gesamten SNpc und erhalten Sie einen vollständigen Satz von Bildern des SNpc. Wenn eine detaillierte Analyse der nicht eingeworfenen Seite erforderlich ist, sollten die Schritte 3.10 bis 3.11 wiederholt werden, indem der Fokus auf die nicht eingeworfene Seite liegt.

4. Bildanalyse und Quantifizierung

1. Trennen Sie Bilddateien mit geeigneter Software und importieren Sie Bilddateien in automatisierte Bildanalysesoftware.
2. Definieren Sie einen bereich von Interesse, indem Sie das Zeichenstift-Anmerkungswerkzeug auswählen, um eine Anmerkung um den SNpc zu zeichnen.
   HINWEIS: In Abschnitten, die einen großen Dopaminergen Neuronenverlust aufweisen, kann eine vorübergehende Erhöhung der Emittanz / Absorption dazu beitragen, den SNpc klar zu definieren (Abbildung 2).
3. Wechseln Sie zur Registerkarte Analyse, und wählen Sie im Dropdown-Menü Analysieren die Option Echtzeitoptimierung aus. Dadurch wird ein separates Fenster auf dem Schnittbild geöffnet, das eine Echtzeitänderung der Analyseparameter ermöglicht (Abbildung 3).
4. Wählen Sie im Abschnitt Analysevergrößerung den entsprechenden Bildzoom aus.
5. Wählen Sie im Abschnitt Zellerkennung den Kernfarbstoff als Farbstoff für die TH-Färbung (Alexa Fluor 488) aus.
6. Passen Sie die Einstellungen für den nuklearen Kontrast, die minimale Kernintensität,die Aggressivität der Kernsegmentierungund die Kerngröße an, während Sie das Fenster "Echtzeit-Optimierung" sorgfältig beobachten.
   HINWEIS: Die genaue Darstellung jeder einzelnen Zelle als einzelne Zelle im Echtzeit-Tuning-Fenster ist für die Genauigkeit von entscheidender Bedeutung. Diese Einstellungen sind je nach verwendeter Software in einem beliebigen Maßstab, aber eine korrekte Anpassung ist erforderlich, damit die Software genau zwischen einzelnen Zellen sowie zwischen Zellen und dem Hintergrund unterscheiden kann (Abbildung 3).
7. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit mindestens 10 separaten Proben, um eine einheitliche Übereinstimmung darüber sicherzustellen, was eine Zelle über verschiedene Abschnitte hinweg ausmacht.
   HINWEIS: Zusätzliche Zellmarker (z. B. α-syn oder NeuN) können innerhalb derselben Analyseplattform mithilfe der Abschnitte Marker 1 oder Marker 2 auf der Registerkarte Analyse identifiziert werden.
8. Sobald eine entsprechende Anzahl von Bildern abgetastet und das Echtzeit-Tuning entsprechend angepasst wurde, speichern Sie die Analyseeinstellungen im Dropdown-Menü Einstellungsaktionen.
9. Wählen Sie alle zu analysierenden Bilder aus und klicken Sie auf Analysieren.
10. Wählen Sie die Analyseeinstellung aus, die Sie gerade gespeichert haben, und aktivieren Sie im Fenster Analysebereich das Kontrollkästchen Anmerkungs-Layer. Aktivieren Sie dann Layer 1 und klicken Sie auf Analysieren.
    HINWEIS: Für ein einzelnes Gehirn dauert die Analyse in der Regel etwa 5 Minuten. Das abgeschlossene Ergebnis zeigt deutlich jedes Element, das als Zelle gezählt wurde (Abbildung 4).
11. Exportieren Sie nach Abschluss die zusammenfassenden Analysedaten für alle Abschnitte. Es gibt eine Option zum Exportieren von Objektanalysedaten, die detaillierte Daten, einschließlich der Zellgröße jeder einzelnen erkannten Zelle, erhalten. Dieser Datensatz könnte verwendet werden, um Veränderungen der Zellgröße als Reaktion auf ein Toxin / Therapeutikum zu untersuchen.
12. Addieren Sie die Gesamtzellen aus jedem analysierten Abschnitt pro Tier und die analysierte Gesamtfläche (mm²). Dividieren Sie die Gesamtzahl der Zellen durch die analysierte Gesamtfläche, um die Anzahl der Zellen/mm² im SNpc für jede Ratte zu berechnen

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Ergebnisse

Durch die Anwendung der oben genannten Methoden auf Hirngewebe, das 6 Wochen nach AAV-Injektionen gesammelt wurde, zeigten wir, dass die stereotaktische Injektion von AAV, die die Mutante A53T α-syn (AAV-A53T) im SNpc des Rattengehirns exprimiert, zu einer signifikanten Verringerung der Dichte dopaminerger Neuronen im Vergleich zur Injektion von leerem Vektor-AAV (AAV-EV) als Kontrolle führt (Abbildung 5A,B). Die mittlere Anzahl von TH-positiven Neuronen/mm² im ...

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Diskussion

Die zuverlässige Beurteilung der Integrität des dopaminergen Systems in präklinischen Modellen der Parkinson-Krankheit ist entscheidend, um die Wirksamkeit potenzieller krankheitsmodifizierender Therapeutika zu bestimmen. Daher ist es wichtig, potenzielle Verrenkungen zu kontrollieren und zu minimieren, die die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit histopathologischer Daten verringern können. Sorgfältige quantitative Ergebnisse können mehr Informationen liefern als qualitative oder semi-quantitative Beschreibunge...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
A-Syn Antibody	ThermoFisher Scientific	32-8100
ABC Elite	Vector Labs	PK-6102
Alexa Fluor 488 secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-11008
Alexa Fluor 555 secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-28180
Alkaline phosphatase-conjugated anti-rabbit igG	Jackson Immuno	111-055-144
Biotinylated anti-mouse IgG	Vector Labs	BA-9200
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153
DAKO fluorescent mouting medium	Agilent	S3023
HALO™	Indica Labs
Histo-Clear II	Diamed	HS202
ImmPACT DAB Peroxidase substrate	Vector Labs	SK-4105
LSM880 Confocal Microscope	Zeiss
NeuN Antibody	Millipore	MAB377
Normal Goat Serum	Vector Labs	S-1000-20
OCT	Tissue-Tek
Paraformaldehyde	BioShop	PAR070.1
Sliding microtome	Leica	SM2010 R
Stereo Investigator	MBF Bioscience
Sucrose	BioShop	SUC700
TH Antibody	ThermoFisher Scientific	P21962
VectaMount mounting medium	Vector Labs	H-5000
Vector Blue Alkaline Phosphatase substrate	Vector Labs	SK-5300
Zen Black Software	Zeiss
Zen Blue Software	Zeiss