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要約

このプロトコルは、内因性代謝補酵素、還元型ニコチンアミドアデニン(リン酸)ジヌクレオチド(NAD(P)H)、および酸化フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)の蛍光イメージングおよび分析について記載しています。NAD(P)HおよびFADの自己蛍光イメージングは、細胞代謝を評価するための標識フリーの非破壊的方法を提供します。

要約

細胞代謝は細胞がエネルギーを生成するプロセスであり、癌を含む多くの疾患は異常な代謝によって特徴付けられる。還元型ニコチンアミドアデニン(リン酸)ジヌクレオチド(NAD(P)H)および酸化型フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)は、代謝反応の補酵素である。NAD(P)HおよびFADは自己蛍光を示し、励起および発光波長によってスペクトル的に単離することができる。両方の補酵素、NAD(P)HおよびFADは、遊離またはタンパク質結合配置のいずれかで存在することができ、それぞれが異なる蛍光寿命(蛍光色素分子が励起状態にとどまる時間)を有する。蛍光寿命イメージング(FLIM)は、細胞代謝の標識のない分析のために、NAD(P)HおよびFADの蛍光強度および寿命の定量化を可能にする。蛍光強度と寿命顕微鏡は、適切な励起波長と発光波長を選択することで、NAD(P)HとFADのイメージングに最適化できます。シアン化物による代謝摂動は、細胞内の代謝変化を検出するための自己蛍光イメージングプロトコルを検証します。本稿では、細胞代謝を測定するためのNAD(P)HおよびFADの自己蛍光イメージング技術を実証する。

概要

代謝は、エネルギーを生産する細胞プロセスです。細胞代謝は、解糖系、酸化的リン酸化、およびグルタミン分解を含む複数の経路を包含する。健康な細胞は、これらの代謝経路を使用して、免疫細胞によるサイトカインの産生などの増殖および機能のためのエネルギーを生成する。代謝障害、癌、神経変性を含む多くの疾患は、細胞代謝の変化によって特徴付けられます1。例えば、一部のがん細胞型は、酸素の存在下でも解糖系の割合が上昇し、核酸、タンパク質、および脂質を合成するための分子を生成します2,3。ウォーバーグ効果として知られるこの現象は、乳がん、肺がん、膠芽腫など、多くのがんタイプの特徴です4。がんの進行に伴う細胞代謝の変化のため、細胞代謝は薬物応答の代理バイオマーカーとなり得る5,6。さらに、細胞の不均一性は個人において異なる薬物応答につながる可能性があるため、細胞レベルで薬物の有効性を理解することは極めて重要です7,8。

細胞代謝の変化を同定および定量化する技術は、がんおよび薬物応答の研究に不可欠です。化学分析およびタンパク質分析は、細胞または組織の代謝を評価するために使用されますが、単一細胞分解能および空間情報が不足しています。代謝プレートリーダーベースのアッセイは、経時的にサンプル中のpHおよび酸素消費量、およびその後の化学物質による代謝摂動を測定することができる。pHを使用して細胞外酸性化率(ECAR)を計算することができ、細胞の解糖系活性に関する洞察が得られます9。2-[フッ素-18]フルオロ-D-グルコース陽電子放射断層撮影法(FDG PET)および磁気共鳴分光法(MRS)を含む全身イメージング法は、代謝測定を通じて腫瘍の再発および薬物有効性を同定するために臨床的に使用される非侵襲的イメージングモダリティである10,11,12,13,14。

FDG-PETは、放射性標識グルコース類似体であるFDGの組織取り込みを画像化する。周囲の組織に対する腫瘍によるFDG-PETの取り込みの増加は、ウォーバーグ効果によるものである12,13。MRSは、13Cや31Pなどの代謝に使用される分子の一般的な核を画像化し、運動や食事などの刺激に応答して代謝がどのように変化するかについての動的情報を得ることができます14。FDG-PETおよびMRSは臨床的に使用することができるが、これらの技術は腫瘍内の不均一性を解決するための空間分解能を欠いている。同様に、酸素消費量の測定は、大量の細胞集団に対して行われます。自己蛍光イメージングは、これらの技術の空間分解能の障害を克服し、細胞代謝を定量化する非侵襲的な方法を提供します。

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図1:一般的な代謝経路におけるNADHおよびFAD。 NADHおよびFADは、解糖系、クレブスサイクル、および電子輸送鎖に使用される補酵素である。これらの分子の自己蛍光イメージングは、細胞代謝に関する情報を提供する。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

還元型ニコチンアミドアデニン(リン酸)ジヌクレオチド(NAD(P)H)および酸化型フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)は、解糖系、酸化的リン酸化系、グルタミン分解系などの代謝反応の補酵素です(図1)。NAD(P)HとFADはどちらも自己蛍光性であり、蛍光イメージングに内因性のコントラストを提供します1,15。NADPHはNADHと同様の蛍光特性を有する。このため、NAD(P)H は、NADH と NADPH2,16 の結合信号を表すためによく使用されます。

蛍光寿命イメージング(FLIM)は、蛍光寿命または蛍光色素分子が励起状態にある時間を定量化します。蛍光の寿命は蛍光色素分子の微小環境に反応し、細胞代謝に関する情報を提供します17。NAD(P)HおよびFADは、タンパク質結合または遊離立体配座のいずれかで細胞内に存在することができ、それぞれが異なる寿命を有する。遊離NAD(P)Hは、タンパク質結合NAD(P)Hよりも寿命が短い。逆に、遊離FADは束縛されたFADよりも寿命が長い18,19。寿命および寿命成分の重みは、蛍光寿命減衰データから式(1)20を通して定量化することができる。

I(t) = α 1e-t/τ1 + α 2e-t/τ2 + C (1)

式(1)は、時間の関数として規格化された蛍光強度を表す。この式のα 1とα 2は、それぞれ短寿命と長寿命(α 1+α 2=1)の比例成分を表し、τ1とτ2はそれぞれ短寿命と長寿命を表し、Cは背景光7,20を表します。振幅加重寿命は、ここではτmとして表され、式(2)を使用して計算されます。

τm= α 1τ1+ α 2τ2 (2)

平均寿命は、蛍光色素分子の強度減衰に対して「t」を平均することによって計算することができ、2指数関数的な減衰の場合、式(3)17,21で示されます。

τ*m= (α 1τ12+ α 2τ22)/ (α 1τ1+ α 2τ2) (3)

蛍光強度画像は、蛍光寿命減衰を積分することにより、寿命画像から計算することができる。自己蛍光イメージングは、生細胞の代謝を細胞内分解能で特徴付けるために使用できる非破壊的で標識のない方法です。光酸化還元比は、セルの化学的酸化還元状態の光学アナログ測定を提供し、NAD(P)HとFAD強度の比として計算されます。光学酸化還元比の計算式は標準化されていませんが22,23,24,25,ここではNAD(P)HとFADを合わせた強度に対するFADの強度と定義しています。この定義が使用されるのは、分母の強度の合計がメトリックを 0 ~ 1 の間で正規化し、シアン化物阻害の予想される結果が酸化還元比の減少であるためです。遊離NAD(P)HおよびFADの蛍光寿命は、pH、温度、酸素への近接性、浸透圧など、代謝溶媒微小環境の変化に関する洞察を提供します17。

NAD(P)HとFADの結合画分の蛍光寿命の変化は、代謝経路の利用と基質特異的代謝を示す可能性があります26。成分重量は、補酵素の遊離から結合画分への変化について解釈することができる18、19。全体として、これらの定量的自己蛍光寿命測定基準は、細胞代謝の分析を可能にし、自己蛍光イメージングは、正常組織からの新生物の同定27,28、幹細胞の特性評価29,30、免疫細胞機能の評価31,32,33,34,35、神経学的活性の測定36、 37、38、および乳癌および頭頸部癌などの癌タイプにおける薬物有効性を理解する21、39、40、41、42。高解像度の自己蛍光イメージングは、単一細胞分析および集団内不均一性の定量化のための画像セグメンテーションと組み合わせることができます43,44,45,46,47。

NAD(P)HおよびFADは、強度または寿命イメージング用に構成された単一光子または多光子蛍光顕微鏡でイメージングできます。単一光子顕微鏡の場合、NAD(P)HとFADは、これらの波長で共通のレーザー光源のために、それぞれ375-405nmと488nmの波長で励起されるのが一般的です48。2光子蛍光励起では、NAD(P)HとFADはそれぞれ約700~750nmと700~900nmの波長で励起します15,49。蛍光色素分子が励起されると、NAD(P)HおよびFADは、それぞれ~410 nm~~490 nmおよび~510 nm~~640 nmの波長で光子を放出します15。NAD(P)HおよびFADの最大発光波長は、それぞれ約450nmおよび535nmである48。

励起波長と発光波長が異なるため、2つの代謝補酵素の蛍光をスペクトル的に単離することができます。NAD(P)HおよびFADのスペクトル特性を理解することは、自己蛍光イメージングプロトコルの設計および最適化に必要です。シアン化物は電子輸送鎖(ETC)錯体IV阻害剤である。細胞代謝に対するシアン化物の影響、ならびに細胞内のNAD(P)HおよびFADの自己蛍光強度および寿命は、よく特徴付けられる27,40。したがって、シアン化物摂動実験は、NAD(P)HおよびFADイメージングプロトコルを検証するための有効な手段である。シアン化物実験が成功すれば、NAD(P)HおよびFADイメージングプロトコルを使用して未知のグループまたは摂動の代謝を評価できるという確信が得られます。

プロトコル

1. イメージング用セルプレーティング

  1. MCF-7細胞の80〜90%コンフルエントT−75フラスコから培地を吸引し、10mLの滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞をすすぎ、2mLの0.25%トリプシン(1x)を加えて細胞をフラスコ底部から剥離する。
  2. フラスコを37°Cで約4分間インキュベートする。顕微鏡で細胞を確認し、剥離を確認します。
  3. 直ちに8mLの培養液を加え、トリプシンを失活させた。
  4. 細胞を円錐形のチューブ(15mLまたは50mL)に集める。血球計数器を用いて細胞を計数する。
  5. 細胞200× g を5分間遠心分離する。
  6. 遠心分離したら、上清を吸引する。細胞のペレットを1mLの培養液に再懸濁し、4×105 個の細胞を35mmガラス底イメージングディッシュ(または使用されている顕微鏡用の適切なサンプルホルダー)上にシードする。
  7. 2mLの培養液をイメージングディッシュに加え、細胞代謝を維持する。
  8. 細胞を37°Cで5%CO2 で24〜48時間インキュベートしてから、細胞が接着して対数増殖期に達するようにイメージングします。
    注:増殖期は、これらの細胞に関する以前の経験によって決定され、細胞データシートで確認された。

2. NAD(P)HとFADの多光子FLIMイメージング

  1. 多光子蛍光寿命顕微鏡のすべてのコンポーネント(顕微鏡、レーザー光源、および使用されている検出器を含む)をオンにします。
  2. サンプルの配置
    1. 明視野ランプを点灯させます。光が接眼レンズに差し込まれていることを確認します。目的(通常は20倍、40倍、または100倍)を選択して細胞イメージングを行います。対物レンズの上に適切な浸漬媒体を1滴塗布します[対気目標を使用する場合はスキップします]。
    2. 対物レンズを下へ移動して、対物レンズに触れることなくサンプルを適切に配置します。ガラス底の皿を顕微鏡ステージ上のサンプルホルダーの上に置きます。試料が固定されており、イメージング中に動かないことを確認します。
    3. X-Yステージコントロールを使用して、試料を対物レンズで中央に配置します。これが完了したら、接眼レンズを覗き込み、目標を上に動かして細胞に焦点を合わせます。
    4. 顕微鏡が筐体内にある場合は、ライトボックスのドアを閉じます。画像取得ソフトウェアを開き、[多光子イメージング]タブをクリックし、次の 多光子イメージング パラメータを設定します:画像サイズ= 256 x 256ピクセル。ピクセル滞留時間 = 4-25 μs;総画像取得時間 = 〜60秒;単一光子カウント用に最適化された検出器ゲイン = 85% (使用されているシステムに固有)。
  3. 機器応答関数(IRF)と蛍光寿命標準のイメージング
    1. ガラス底の皿に尿素結晶を置き、皿の蓋をテープまたはパラフィルムで固定する。
      注:尿素結晶は室温で数ヶ月間安定しています。
    2. 尿素結晶をイメージしてください。
      1. 尿素皿を顕微鏡ステージに置き、尿素結晶に焦点を合わせます。
      2. 励起レーザーの波長を900nmに設定します。
      3. 450nmの波長をキャプチャする発光フィルターを使用してください。
      4. サンプル<1mWでレーザー出力で尿素結晶の蛍光寿命画像を取得し、ステップ2.2.4で述べた推奨イメージングパラメータを使用します。
    3. 黄緑色(YG)ビーズを蛍光寿命標準として画像化します。
      1. YGビーズ溶液を滅菌水で1:1,000に希釈してYGビーズスライドを作成する。少量(約30 μL)をスライドまたはガラス底の皿の上に置きます。カバースリップで覆い、カバースリップの端を透明なマニキュアで密封します。
      2. YGビーズスライドを顕微鏡ステージに置き、スライドのカバースリップ側を対物レンズの方に置きます。
      3. 励起レーザーの波長を890 nmに設定します。
      4. 〜500〜600nmの波長をキャプチャする発光フィルタを使用してください。
      5. サンプル<1mWでのレーザーパワーと推奨画像パラメータを用いてYGビーズの蛍光寿命画像を得る[ステップ2.2.4]。
      6. 尿素のIRFを使用してビーズの寿命を確認してください。寿命が〜2.1nsでない場合は、ビーズが蛍光消光に寄与する別のビーズと接触しているかどうか、ビーズ溶液が乾燥しているかどうか、ビーズの焦点が合っていないかどうか、IRFが正確でないかどうか、またはIRFと蛍光減衰の間のシフトが最適化されていないかどうかを確認します[ステップ4.2.4を参照]。
        注: ~2.1 ns の寿命は、時間の経過とともに安定しています。
  4. NAD(P)Hイメージング
    1. 細胞を入れたガラス底の皿を顕微鏡ステージに置き、細胞に焦点を合わせます。
      注:これらのパラメータは細胞代謝に影響を与える可能性があるため、画像取得中に熱、湿度、およびCO2 レベルを維持するために、細胞を環境チャンバに配置することをお勧めします。
    2. 検出器のゲインをFLIMの最適値に調整します。さらに、所望の滞留時間(試料の各ピクセルでレーザーが費やす時間を示すパラメータ)に変更します。
      メモ: これらのパラメータは、手順の残りの部分で同じままにする必要があります。これは、レーザー出力、スキャンパラメータ、検出器ゲインに依存する強度ベースの測定の有効性を保証するために、レーザー照明と検出器の設定の一貫性を確保するためです。単一光子計数モードで検出器を操作するための最適化された検出器ゲインがあります。この値は、参照されるシステムの 85% です。
    3. 多光子レーザーを750nmに設定します。レーザーのシャッターを開いたときにセルが損傷しないように、レーザーのパワーコントロールが最初にゼロに設定されていることを確認します。
      注: 750 nm での励起が NAD(P)H に推奨されますが、700 ~ 750 nm で広い吸収があります。FADには890 nmでの励起が推奨されますが、700-900 nmで広い吸収があります。
    4. 発光フィルターを設定または選択して、約400〜500nmの発光波長を収集します。
    5. ピント合わせまたはライブビュー方式でイメージングを開始し、画像設定を最適化します。
      メモ: レーザーは現在動作しています。この時点では、顕微鏡エンクロージャーを開けないでください。適切な個人用保護具を着用してください。
    6. レーザー出力をサンプルで約3〜8mWまでゆっくりと増やし、細胞に焦点が合っていることを確認します。調整が完了したら、最大使用電力を記録します。この電源設定は、NAD(P)Hイメージング用のペトリ皿の他のセグメントのイメージングに使用します。
      注:ポッケルセルは安定していないため、サンプルまたはピックオフウィンドウでレーザーパワーを測定し、ポッケルセル電圧に依存しないことが重要です。多くの場合、レーザー出力は、サンプルではなくピックオフウィンドウでイメージング中に監視されます。対物レンズで2番目のパワーメータを使用して、ピックオフウィンドウでのパワーとサンプルでのパワーの関係を使用して、ピックオフウィンドウの測定値からサンプルでのおおよそのパワーを推定できます。
    7. 画像統合時間が 60 秒の NAD(P)H FLIM 画像を収集します。
    8. 画像に蛍光寿命減衰曲線内に十分な光子(細胞質ピクセルに対して〜100光子のピーク)があることを確認してください。光子の数が少なすぎる場合は、レーザー出力または画像取得の時間を長くします。
      注:蛍光指数減衰内の光子の最小ピーク数は、時間分解能、IRF、およびバックグラウンドノイズなどのシステムパラメータに依存する。
  5. FADイメージング
    1. 多光子レーザーを890nmに設定し、新しい波長でモードロックするのを待ちます。レーザーのシャッターを開いたときにセルが損傷しないように、レーザーのパワーコントロールが最初にゼロに設定されていることを確認します。
      メモ: このステップを実行するときは、ステージまたは目標のフォーカスを移動しないでください。FAD 視野 (FOV) は、この画像の NAD(P)H FOV と直接一致する必要があります。
    2. 発光フィルターを設定または選択して、約500〜600nmの発光波長を収集します。
    3. ピント合わせまたはライブビュー方式でイメージングを開始し、画像設定を最適化します。
      メモ: レーザーは現在動作しています。この時点では、顕微鏡エンクロージャーを開けないでください。
    4. サンプルでレーザー出力を約5〜10mWまでゆっくりと増やし、使用された最大出力を記録します。これは、FADイメージング用のペトリ皿の他のセグメントのイメージングの電源設定として使用します。
    5. 画像統合時間が 60 秒の FAD FLIM 画像を収集します。
    6. 画像に蛍光寿命減衰曲線内に十分な光子(細胞質ピクセルに対して〜100光子のピーク)があることを確認してください。光子の数が少なすぎる場合は、レーザー出力または画像取得の時間を長くします。
      注:蛍光指数減衰内の光子の最小ピーク数は、時間分解能、IRF、およびバックグラウンドノイズなどのシステムパラメータに依存する。
  6. 手順 2.4 ~ 2.5 を 4 ~ 5 個の FOV で繰り返します。各イメージが、イメージされた場所から少なくとも 2 FOV 離れていることを確認します。

シアン化物実験準備

  1. 130.24mgのシアン化ナトリウムを25mLのPBSに溶解して、80mM(20x)シアン化ナトリウム溶液を作る。
    注:シアン化物は有毒です。適切な個人用保護具を着用してください。
  2. ディッシュから100μLの培養液を吸引する。これを100 μLのシアン化ナトリウム溶液と交換して、ディッシュ中のシアン化物の4 mM濃度を得た。
  3. 細胞をインキュベーターに5分間入れて、細胞がシアン化物溶液と反応することを可能にする。
  4. 手順2.4~2.6を繰り返して、シアン化物曝露後の細胞のNAD(P)HおよびFAD画像を取得します。
    注:シアン化物への長期暴露は細胞を殺すでしょう。シアン化物後画像は、シアン化物添加から30分以内に取得される。

4. FLIM画像解析

  1. FLIM 寿命解析ソフトウェアを開きます。
    1. 尿素画像を開き、測定されたIRFを取得します。
    2. 尿素イメージをインポートします。画像解析に使用する尿素結晶の画像上の点を選択します。メインソフトウェアインターフェイスにあるBin変数を変更して、減衰ピークが100光子の場合、複数のピクセルからのFLIMデータを1以上>積算するには、空間ビン値を大きくします。
    3. データを IRF として保存します。
      1. 参照先のソフトウェアで、「 IRF」というタイトルのドロップダウンメニューをクリックし、「 減衰データからコピー」を選択します。この後、[ クリップボードにコピー ]をクリックして、実験中に撮影した画像の画像解析に利用します。
  2. NAD(P)HおよびFAD寿命画像の画像解析
    1. 画像ファイルを蛍光寿命解析ソフトウェアにインポートします。
    2. 必要に応じて強度とコントラストを変更することで、細胞と細胞内コンパートメントを見るための画像視覚化を改善します。
      1. [オプション]ドロップダウンメニューをクリックし、[強度]を選択します。ここで、必要に応じて強度とコントラストを変更し、[OK]をクリックします。
    3. 尿素イメージから IRF をインポートします。
      1. [IRF] ドロップダウン メニューをクリックし、[クリップボードから貼り付け] を選択します。
    4. 多指数減衰パラメータ50を設定します。
      1. 細胞質ピクセルの減衰を評価するしきい値を設定します。
        注: ここでは、値 50 が使用されました。この値は、いくつかの代表的なバックグラウンドおよび核画素の蛍光ピーク値をいくつかの細胞質画素のピーク値と比較することによって選択した。核画素と細胞質画素との間の値を閾値として選択した。
    5. Shift 値が蛍光の立ち上がりエッジを基準にして IRF を揃えていることを確認します。必要に応じて、カイ 2 乗値を最小化する値にシフトを調整します。
    6. 細胞質ピクセルの蛍光ピーク値が 100 以上になるように空間ビンを増やします。
      注: 空間ビンを増やすと、空間分解能が低下します。
    7. 画像内のすべてのピクセルの蛍光寿命を計算します。
      1. 参照先のプログラムで、[ 計算] ドロップダウン メニュー |減衰マトリックス。
        注:成功は、振幅加重蛍光寿命に対して偽色の画像で示されます。
    8. 蛍光寿命データを保存します。
      1. [ ファイル ]ドロップダウンメニュー |エクスポート。解析に使用するパラメータを選択し、[ OK]をクリックします。画像を保存します。
      2. [オプション]ドロップダウンメニューから[色]ボタンを選択して、表示される蛍光寿命メトリックを調整し、カラー設定をB-G-Rに調整し、特定のカラーバーの最小値と最大値を設定して蛍光寿命画像のカラースケールを調整します。

figure-protocol-7106
図2:尿素結晶のIRFを測定した。 (a)尿素から得られた強度画像。細胞の蛍光寿命画像のその後の分析のために、IRF減衰曲線(B)を作成するために代表ピクセルを選択した。省略形: IRF = 計測器応答関数。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

  1. セルのセグメンテーション
    メモ: ここで説明するプロトコルは、画像解析ソフトウェア51を使用します。代表的なMCF-7画像とデータ解析コードを提供します52。
    1. MCF7_Segmentation_Final.cpproj ファイル52 をダウンロードします。
    2. MCF7_Segmentationパイプラインをインポートするには、[ファイル|]をクリックします。 インポート|ファイル からパイプラインを選択し、 ファイルMCF7_Segmentation_Final.cpprojを選択します。
    3. 画像モジュールをクリックし、セグメント化する NAD(P)H 強度 画像 を追加します。
      メモ: 画像は.tif形式、.png形式、または.jpg形式である必要があります。
    4. 左下の [画像の分析 ]ボタンを押します。
      メモ: パイプラインでは、異なるシステムで取得した画像の最適化が必要な場合があります。トラブルシューティングを行うには、次のサブステップを試してください。
      1. さまざまなパラメータをテストするために テスト モードを使用する:「 テストモードの開始 」をクリックし、モジュール名の横にある 再生 ボタンをクリックして各モジュールを実行します。
      2. 最初の IdentifyPrimaryObjects モジュールをクリックし、セルの直径と一致するように、 オブジェクトの典型的な直径をピクセル単位 (最小、最大) で 調整します。
        注: MCF-7 セルでは、最小値と最大値にそれぞれ 10 ピクセルと 40 ピクセルが使用されました。
      3. [EnhanceOrSuppressFeatures] モジュールをクリックし、[フィーチャ サイズ] を調整して、選択したフィーチャ タイプの識別性を向上させます。
        注: MCF-7 セルには 10 ピクセルのフィーチャ サイズが使用されました。
      4. 2 番目の エンハンスまたはサプレッションフィーチャー モジュールをクリックし、「 穴のサイズの範囲」 を調整して、核領域の強化を最適化します。
        注:MCF-7セルには5〜20の範囲が使用されました。
      5. 2 番目の IdentifyPrimaryObjects モジュールをクリックし、パラメーター (しきい値戦略、しきい値 調整方法、しきい値 平滑化スケール、および しきい値補正係数) を調整して、核の識別を最適化します。各パラメータの横にある ? をクリックして最適な設定を特定し、 IdentifySecondaryObjects モジュールに適用します。
      6. FilterObjects モジュールをクリックし、領域の形状を調整します。識別する領域形状の最小ピクセルと最大ピクセルを選択します。
        注: MCF-7 セルでは、それぞれ最大値と最小値に 100 と 500 を使用しました。核を同定し、細胞境界への伝播を行うことによる細胞セグメンテーションの過程は、WalshおよびSkala47によって詳細に説明される。
    5. 細胞質マスクを使用して、画像内の各細胞の蛍光寿命出力変数を平均化する。

figure-protocol-9557
図3:個々の細胞の同定とセグメンテーション。 蛍光寿命画像を積分したMCF7細胞(A)のNAD(P)H強度画像。細胞を、5mWで750nm励起を用いて60秒間画像化した。x 軸と y 軸は、イメージのピクセル位置を表します。(a)個々の細胞を同定した。細胞をマスクし(B)、データセットからバックグラウンドノイズを除去した。その後、核が同定され(C)、セルマスク(D)に投影された。次いで、細胞を濾過(E)して、典型的な細胞のサイズに適合しないマスクされた領域を除去した。スケール バー = 50 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

5.代替方法:蛍光強度イメージング

  1. 実験中に使用する機器の電源を入れます。
    注:蛍光強度画像は、広視野蛍光顕微鏡、共焦点蛍光顕微鏡、または多光子顕微鏡で取得できます。
    1. 使用する顕微鏡に、NAD(P)H (単一光子波長~370~405 nm: 2 光子波長~700~750 nm) および FAD (単一光子波長~488 nm、2 光子波長~890 nm) の適切な励起源があることを確認します。
    2. 顕微鏡にNAD(P)H発光(〜400〜500nm)を分離するためのフィルターがあることを確認してください。
      注:4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)設定は、NAD(P)Hに対してしばしば機能します。
    3. 顕微鏡にFAD発光(〜500〜600nm)を分離するためのフィルターがあることを確認します。
      注:緑色蛍光タンパク質(GFP)の設定は、多くの場合、FADに対して機能します。
  2. 顕微鏡を準備する。
    1. 明視野ランプを点灯させます。光が接眼レンズに差し込まれていることを確認します。必要に応じて、対応する対物レンズの上に適切な浸漬媒体を1滴塗布します。
    2. 対物レンズを下へ動かして、干渉することなくサンプルを適切に配置します。ペトリ皿をステージ上に正しく置きます。試料が固定されており、イメージング中に動かないことを確認します。
      注:これらのパラメータは細胞代謝に影響を与える可能性があるため、画像取得中に熱、湿度、およびCO2 レベルを維持するために、細胞を環境チャンバに配置することをお勧めします。
    3. 試料を目標の中央に配置します。これが完了したら、接眼レンズを覗き込み、セルに焦点が合っているように見えるまで対物レンズを動かします。
  3. 強度イメージングを開始します。
    1. イメージングソフトウェアを開き、画像取得ソフトウェアのキャプチャタブをクリックし、顕微鏡タレットにNAD(P)H励起および発光フィルタを配置して、励起および発光構成を設定してNAD(P)Hを キャプチャ します。
      注:NAD(P)Hイメージングには、357/44励起フィルタ、409ロングパスダイクロイック、および447/60発光フィルタが使用されました。
    2. 励起照明と検出器のパラメータを最適化します。漂白が問題になる場合は、照明強度を下げ、画像統合時間を長くします。
      注: NAD(P)H は弱い信号です。あまりにも多くの電力が使用されている場合は、漂白に注意してください。
    3. 目的の画像サイズのNAD(P)H画像を取得します。イメージが保存されていることを確認します。
    4. FADをキャプチャするように励起および発光構成を設定します。励起照明と検出器のパラメータを最適化します。
      注:FADイメージングには、458/64励起フィルタ、495ロングパスダイクロイック、および550/88発光フィルタが使用されました。
    5. FAD イメージを取得します。イメージが保存されていることを確認します。
      注:NAD(P)HおよびFAD画像取得パラメータ(照明強度、画像サイズ、検出器ゲイン)は、イメージング実験を通して 同じ ままである必要があります。
    6. イメージされた場所から少なくとも 2 つの FOV を離して、さらに 5 つの場所でこのプロセスを繰り返します。
  4. 画像レベルの酸化還元比データ解析
    1. 画像処理プログラムでNAD(P)HおよびFAD強度画像を開きます。
    2. NAD(P)H にしきい値を設定して細胞質ピクセルを保持し、背景ピクセルと核ピクセルを 0 に設定します。
    3. 閾値化されたNAD(P)H画像を使用して、各ピクセルでFAD/(NAD(P)H + FADの式を評価して、酸化還元比画像を計算します。
    4. 0 以外のピクセルの平均値を計算します。
      メモ: これらの手順は、画像解析ソフトウェアで実行することも、スクリプトで直接コーディングすることもできます。
  5. 細胞レベルの酸化還元比分析
    1. 手順 4.3.1 ~ 4.3.5 に従って、各 NAD(P)H 画像内のセルのマスク画像を取得します。
    2. 各ピクセルで式FAD/(NAD(P)H + FAD)を評価して、酸化還元比画像を計算します。
    3. 細胞質マスクを使用して、画像内の各細胞のすべてのピクセルの酸化還元率を平均化する。

結果

上皮乳癌細胞株MCF-7を、10%ウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加したDMEM中で培養した。蛍光画像化のために、細胞を、画像化の48時間前に35mmガラス底画像化皿当たり4×105細胞の密度で播種した。細胞をシアン化物処理の前後に、上記のプロトコールを用いて画像化した。シアン化物実験の目的は、NAD(P)HおよびFAD蛍光のスペクトル分離を確認し、細胞の代謝?...

ディスカッション

自己蛍光強度および寿命イメージングは、細胞における代謝を評価するために広く使用されている21,55。FLIMは高分解能であり、したがって単一細胞を解決し、細胞の不均一性が腫瘍の攻撃性および薬剤耐性に寄与するため、癌研究にとって重要である7,39,41,44,45,46,58。

開示事項

著者らは、開示する利益相反はありません。

謝辞

資金源には、Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT RP200668) とTexas A&M Universityが含まれる。 図 1 は、BioRender.com を使用して作成されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
2-deoxy-d-glucose (2-DG)SigmaAC111980000; AC111980010; AC111980050; AC111980250
Antibiotic Antimicrobial (pen-strep)Gibco15240096
Cell SamplesAmerican Type Culture CollectionN/AMCF-7 cancer line
CellProfilerBroad InstituteN/AImage analysis software
Conical TubeVWR89039-66415 mL conical tube
DMEMThermoFisher11965092Culture media
FAD dichroic mirrorSemrockFF495-Di03-25x36495 nm
FAD emission filterSemrockFF01-550/88-25550/88 nm
FAD excitation filterSemrockFF01-458/64-25458/64 nm
FBSThermoFisher16000036
Fluorescence Lifetime Microscope3iN/A
Glass bottom dishMatTek CorpP35G-1.0-14-C
Multiphoton LaserCoherentN/A2P Coherent Laser, Tunable 680 nm-1080 nm
NAD(P)H dichroic mirrorSemrockFF409-Di03-25x36409 nm
NAD(P)H emission filterSemrockFF02-447/60-25447/60 nm
NAD(P)H excitation filterSemrockFF01-357/44-25357/44 nm
PBSThermoFisher70011044
Potassium CyanideSigma-Aldrich380970
SlideBooks 63iN/AImage acquisition software
SPCImageBecker & Hickl GmbHN/AFluorescence lifetime analysis software
Stage Top IncubatorokoLabN/A
TrypsinBiosciences786-262
UreaSigma-AldrichU5128
YG beadsPolysciences19096-2Yg microspheres (20.0 µm)

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