Autofluoreszenzbildgebung zur Beurteilung des Zellstoffwechsels

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Fluoreszenzbildgebung und Analyse der endogenen metabolischen Coenzyme, des reduzierten Nicotinamidadenins (Phosphat) -Dinukleotids (NAD (P) H) und des oxidierten Flavinadenindinukleotids (FAD). Die Autofluoreszenzbildgebung von NAD(P)H und FAD bietet eine markierungsfreie, zerstörungsfreie Methode zur Beurteilung des Zellstoffwechsels.

Zusammenfassung

Der Zellstoffwechsel ist der Prozess, durch den Zellen Energie erzeugen, und viele Krankheiten, einschließlich Krebs, sind durch einen abnormalen Stoffwechsel gekennzeichnet. Reduziertes Nicotinamidadenin (Phosphat) Dinukleotid (NAD(P)H) und oxidiertes Flavinadenindinukleotid (FAD) sind Coenzyme von Stoffwechselreaktionen. NAD(P)H und FAD weisen Autofluoreszenz auf und können spektral durch Anregung und Emissionswellenlängen isoliert werden. Beide Coenzyme, NAD (P) H und FAD, können entweder in einer freien oder proteingebundenen Konfiguration vorliegen, von denen jedes eine ausgeprägte Fluoreszenzlebensdauer hat - die Zeit, für die das Fluorophor im angeregten Zustand verbleibt. Die Fluoreszenz-Lebensdauerbildgebung (FLIM) ermöglicht die Quantifizierung der Fluoreszenzintensität und Lebensdauer von NAD(P)H und FAD für eine markierungsfreie Analyse des Zellstoffwechsels. Fluoreszenzintensitäts- und Lebensdauermikroskope können für die Bildgebung von NAD(P)H und FAD optimiert werden, indem die geeigneten Anregungs- und Emissionswellenlängen ausgewählt werden. Metabolische Störungen durch Cyanid verifizieren Autofluoreszenz-Bildgebungsprotokolle, um metabolische Veränderungen in Zellen zu erkennen. Dieser Artikel demonstriert die Technik der Autofluoreszenzbildgebung von NAD(P)H und FAD zur Messung des Zellstoffwechsels.

Einleitung

Stoffwechsel ist der zelluläre Prozess der Energieerzeugung. Der Zellstoffwechsel umfasst mehrere Wege, einschließlich Glykolyse, oxidative Phosphorylierung und Glutaminolyse. Gesunde Zellen nutzen diese Stoffwechselwege, um Energie für die Proliferation und Funktion zu erzeugen, wie zum Beispiel die Produktion von Zytokinen durch Immunzellen. Viele Krankheiten, einschließlich Stoffwechselstörungen, Krebs und Neurodegeneration, sind durch einen veränderten Zellstoffwechsel ^{gekennzeichnet1}. Zum Beispiel haben einige Krebszelltypen erhöhte Glykolyseraten, selbst in Gegenwart von Sauerstoff, um Moleküle für die Synthese von Nukleinsäuren, Proteinen und Lipiden zu ^erzeugen2,3. Dieses Phänomen, das als Warburg-Effekt bekannt ist, ist ein Kennzeichen vieler Krebsarten, einschließlich Brustkrebs, Lungenkrebs und Glioblastome4^. Aufgrund der Veränderungen des Zellstoffwechsels, die mit dem Fortschreiten der Krebserkrankung verbunden sind, kann der Zellstoffwechsel ein Surrogat-Biomarker für die Arzneimittelreaktion ^sein5,6. Darüber hinaus ist das Verständnis der Arzneimittelwirksamkeit auf zellulärer Ebene von entscheidender Bedeutung, da die Zellheterogenität bei Individuen zu unterschiedlichen Arzneimittelreaktionen führen ^kann7,8.

Technologien, die Veränderungen im Zellstoffwechsel identifizieren und quantifizieren, sind für Studien zu Krebs und Medikamentenreaktion unerlässlich. Chemische und Proteinanalysen werden verwendet, um den Stoffwechsel von Zellen oder Geweben zu bewerten, aber es fehlen Einzelzellauflösungen und räumliche Informationen. Metabolische Plattenleser-basierte Assays können den pH- und Sauerstoffverbrauch in der Probe im Laufe der Zeit und die anschließende metabolische Störung durch Chemikalien messen. Über den pH-Wert kann die extrazelluläre Versauerungsrate (ECAR) berechnet werden, die einen Einblick in die glykolytische Aktivität der Zellen ^gibt9. Bildgebende Ganzkörpermethoden, einschließlich 2-[Fluor-18] Fluor-D-Glucose-Positronen-Emissions-Tomographie (FDG PET) und Magnetresonanzspektroskopie (MRS), sind nichtinvasive Bildgebungsmodalitäten, die klinisch verwendet werden, um Tumorrezidive und Arzneimittelwirksamkeit durch metabolische Messungen zu identifizieren10,11,12,13,14.

FDG-PET bildet die Gewebeaufnahme von FDG, einem radioaktiv markierten Glukoseanalogon, ab. Die erhöhte Aufnahme von FDG-PET durch Tumore im Verhältnis zum umgebenden Gewebe ist auf den Warburg-Effekt ^{zurückzuführen12,13.} MRS bildet gemeinsame Kerne von Molekülen ab, die für den Stoffwechsel verwendet werden, wie ^13C und 31P, und kann dynamische Informationen darüber erhalten, wie sich der Stoffwechsel als Reaktion auf Reize wie Bewegung oder Essen ^{verändert14.} Obwohl FDG-PET und MRS klinisch eingesetzt werden können, fehlt diesen Technologien die räumliche Auflösung, um die intratumorale Heterogenität aufzulösen. Ebenso werden Sauerstoffverbrauchsmessungen an einer Massenpopulation von Zellen durchgeführt. Die Autofluoreszenzbildgebung überwindet das räumliche Auflösungshindernis dieser Technologien und bietet eine nichtinvasive Methode zur Quantifizierung des Zellstoffwechsels.

Abbildung 1: NADH und FAD in gemeinsamen Stoffwechselwegen. NADH und FAD sind Coenzyme, die in der Glykolyse, im Krebszyklus und in der Elektronentransportkette verwendet werden. Die Autofluoreszenzbildgebung dieser Moleküle liefert Informationen über den Zellstoffwechsel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Reduziertes Nicotinamidadenin (Phosphat) Dinukleotid (NAD(P)H) und oxidiertes Flavinadenindinukleotid (FAD) sind Coenzyme von Stoffwechselreaktionen, einschließlich Glykolyse, oxidativer Phosphorylierung und Glutaminolyse (Abbildung 1). Sowohl NAD(P)H als auch FAD sind autofluoreszierend und bieten einen endogenen Kontrast für die Fluoreszenzbildgebung1,15. NADPH hat ähnliche fluoreszierende Eigenschaften wie NADH. Aus diesem Grund wird NAD(P)H häufig verwendet, um das kombinierte Signal von NADH und NADPH2,16 darzustellen.

Die Fluoreszenzlebensdauerbildgebung (FLIM) quantifiziert die Fluoreszenzlebensdauer oder die Zeit, für die sich ein Fluorophor im angeregten Zustand befindet. Fluoreszenzlebensdauern reagieren auf die Mikroumgebung der Fluorophore und liefern Informationen über den ^{Zellstoffwechsel17}. NAD(P)H und FAD können in Zellen entweder in proteingebundenen oder freien Konformationen existieren, von denen jede eine andere Lebensdauer hat. Freies NAD(P)H hat eine kürzere Lebensdauer als proteingebundenes NAD(P)H; Umgekehrt hat die freie FAD eine längere Lebensdauer als die gebundenen ^FAD18,19. Die Lebensdauern und Lebensdauerkomponentengewichte können aus Fluoreszenz-Lebensdauerzerfallsdaten durch Gl. (1)²⁰ quantifiziert werden:

I(t) = α _1e-t/τ1 + α ^_2e-t/_τ2 + C (1)

Eq (1) stellt die normierte Fluoreszenzintensität als Funktion der Zeit dar. Die α ₁ und α ₂ in dieser Gleichung stellen die proportionalen Komponenten der kurzen und langen Lebensdauer (α ₁+ α ₂=1) dar, _τ1 und _τ2 die kurze bzw. lange Lebensdauer und C das ^{Hintergrundlicht7,20}. Die amplitudengewichtete Lebensdauer, hier dargestellt als _τm, wird mit Gleichung (2) berechnet.

_τm= α _1τ1+ α _2τ2 (₂)

Eine mittlere Lebensdauer kann durch Mittelung von "t" über den Intensitätszerfall des Fluorophors berechnet werden, was für einen zweiexponentiellen Zerfall durch Gl. (3)^17,21 dargestellt wird.

τ*_m= (α 1τ12+ α ^2τ22)/ (α _1τ1+ α _2τ2) (3)

Ein Fluoreszenzintensitätsbild kann aus dem Lebensdauerbild berechnet werden, indem der Fluoreszenzlebensdauerzerfall integriert wird. Die Autofluoreszenzbildgebung ist eine zerstörungsfreie und markierungsfreie Methode, mit der der Stoffwechsel lebender Zellen mit subzellulärer Auflösung charakterisiert werden kann. Das optische Redoxverhältnis liefert eine optische Analogmetrik des chemischen Redoxzustands der Zelle und wird als Verhältnis von NAD(P)H- und FAD-Intensitäten berechnet. Obwohl die Formel zur Berechnung des optischen Redoxverhältnisses nicht standardisiert ^{ist22,23,24,25}, wird sie hier als die Intensität von FAD über die kombinierten Intensitäten von NAD(P)H und FAD definiert. Diese Definition wird verwendet, weil die summierte Intensität im Nenner die Metrik zwischen 0 und 1 normalisiert und das erwartete Ergebnis der Cyanidhemmung eine Abnahme des Redoxverhältnisses ist. Die Fluoreszenzlebensdauern von freiem NAD(P)H und FAD liefern Einblicke in Veränderungen in der metabolischen Lösungsmittelmikroumgebung, einschließlich pH-Wert, Temperatur, Nähe zu Sauerstoff und ^{Osmolarität17.}

Veränderungen in der Fluoreszenzlebensdauer der gebundenen Fraktionen von NAD(P)H und FAD können auf die Nutzung des Stoffwechselwegs und den substratspezifischen Stoffwechsel ^hinweisen26. Komponentengewichte können für Änderungen der freien zur gebundenen Fraktion der Coenzyme interpretiert ^werden18,19. Insgesamt ermöglichen diese quantitativen Autofluoreszenz-Lebenszeitmetriken die Analyse des Zellstoffwechsels, und die Autofluoreszenz-Bildgebung wurde zur Identifizierung von Neoplasmen aus normalem Gewebe verwendet27,28, zur Charakterisierung von Stammzellen29,30, zur Bewertung der Immunzellfunktion31,32,33,34,35^, zur Messung der neurologischen ^{Aktivität36, 37,38}, und Verständnis der Arzneimittelwirksamkeit bei Krebsarten wie Brustkrebs und Kopf-Hals-Krebs21,39,40,41,42. Hochauflösende Autofluoreszenzbildgebung kann mit Bildsegmentierung für die Einzelzellanalyse und Quantifizierung der intrapopulationären Heterogenität kombiniert werden43,44,45,46,47.

NAD(P)H und FAD können auf Einzelphotonen- oder Multiphotonen-Fluoreszenzmikroskopen abgebildet werden, die für die Intensitäts- oder Lebensdauerbildgebung konfiguriert sind. Bei Einzelphotonenmikroskopen werden NAD(P)H und FAD aufgrund üblicher Laserquellen bei diesen Wellenlängen typischerweise bei Wellenlängen von 375-405 nm bzw. 488 nm ^angeregt48. Bei der Zwei-Photonen-Fluoreszenzanregung werden NAD(P)H und FAD bei Wellenlängen von etwa 700 bis 750 nm bzw. 700 bis 900 nm bzw. ^15,49 anregen. Sobald die Fluorophore angeregt sind, emittieren NAD(P)H und FAD Photonen bei Wellenlängen zwischen ~410 nm bis ~490 nm bzw. ~510 nm bis ~^{640 nm15}. Die maximalen Emissionswellenlängen NAD(P)H und FAD betragen etwa 450 nm bzw. 535 nm48.

Aufgrund ihrer unterschiedlichen Anregungs- und Emissionswellenlängen kann die Fluoreszenz der beiden metabolischen Coenzyme spektral isoliert werden. Ein Verständnis der spektralen Eigenschaften von NAD(P)H und FAD ist für das Design und die Optimierung von Autofluoreszenz-Bildgebungsprotokollen notwendig. Cyanid ist ein Elektrontransportkette (ETC) -Komplex-IV-Inhibitor. Die Auswirkungen von Cyanid auf den Zellstoffwechsel und die Autofluoreszenzintensitäten und Lebensdauern von NAD(P)H und FAD in Zellen sind gut ^{charakterisiert27,40}. Daher ist ein Cyanid-Störungsexperiment ein wirksames Mittel zur Validierung von NAD(P)H- und FAD-Bildgebungsprotokollen. Ein erfolgreiches Cyanidexperiment gibt die Gewissheit, dass das NAD(P)H- und FAD-Bildgebungsprotokoll verwendet werden kann, um den Stoffwechsel unbekannter Gruppen oder Störungen zu beurteilen.

Protokoll

1. Zellbeschichtung für die Bildgebung

1. Saugen Sie das Medium aus einem 80-90% igen konfluierenden T-75-Kolben von MCF-7-Zellen ab, spülen Sie die Zellen mit 10 ml steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und fügen Sie 2 ml 0,25% Trypsin (1x) hinzu, um die Zellen vom Kolbenboden zu lösen.
2. Den Kolben bei 37 °C für ~4 min inkubieren. Überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um die Ablösung zu bestätigen.
3. Fügen Sie sofort 8 ml Kulturmedium hinzu, um das Trypsin zu deaktivieren.
4. Sammeln Sie die Zellen in einem konischen Schlauch (15 ml oder 50 ml). Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
5. Zentrifugieren Sie die Zellen 200 × g für 5 min.
6. Nach der Zentrifugation den Überstand aspirieren. Resuspendiert das Zellpellet in 1 ml Kulturmedium und sät 4 × 105 Zellen auf eine ³⁵ mm Glasboden-Bildgebungsschale (oder den entsprechenden Probenhalter für das verwendete Mikroskop).
7. Geben Sie 2 ml Kulturmedium in die bildgebende Schale, um den Zellstoffwechsel aufrechtzuerhalten.
8. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 5% _CO2 für 24-48 h vor der Bildgebung, damit die Zellen haften bleiben und die logarithmische Wachstumsphase erreichen.
   HINWEIS: Die Wachstumsphase wurde durch vorherige Erfahrungen mit diesen Zellen bestimmt und mit dem Zelldatenblatt bestätigt.

2. Multiphotonen-FLIM-Bildgebung von NAD(P)H und FAD

1. Schalten Sie alle Komponenten des Multiphotonenfluoreszenz-Lebensdauermikroskops ein, einschließlich des Mikroskops, der Laserquelle und der verwendeten Detektoren.
2. Platzierung der Proben
   1. Schalten Sie die Hellfeldlampe ein. Stellen Sie sicher, dass Licht in das Okular gelangt. Wählen Sie ein Objektiv, normalerweise 20x, 40x oder 100x für die Zellbildgebung. Tragen Sie 1 Tropfen des entsprechenden Tauchmediums auf das Objektiv auf [überspringen, wenn Sie ein Luftobjektiv verwenden].
   2. Bewegen Sie das Objektiv nach unten, um die Probe richtig zu platzieren, ohne das Objektiv zu berühren. Legen Sie die Glasbodenschale auf den Probenhalter auf dem Mikroskoptisch. Stellen Sie sicher, dass die Probe sicher ist und sich während der Bildgebung nicht bewegt.
   3. Zentrieren Sie die Probe mit dem Objektiv mit der X-Y-Stufensteuerung. Sobald dies erledigt ist, schauen Sie in das Okular und bewegen Sie das Objektiv nach oben, um sich auf die Zellen zu konzentrieren.
   4. Wenn sich das Mikroskop in einem Gehäuse befindet, schließen Sie die Leuchtkastentür. Öffnen Sie die Bilderfassungssoftware, klicken Sie auf die Registerkarte Multiphotonen-Bildgebung und legen Sie die folgenden Multiphotonen-Bildgebungsparameter fest: Bildgröße = 256 x 256 Pixel; Pixelverweilzeit = 4-25 μs; Gesamtbildaufnahmezeit = ~60 s; Optimierte Detektorverstärkung für Einzelphotonenzählung = 85% (spezifisch für das verwendete System).
3. Bildgebung der Instrument Response Function (IRF) und des Fluorescent Lifetime Standard
   1. Legen Sie Harnstoffkristalle auf eine Glasbodenschale und befestigen Sie den Geschirrdeckel mit Klebeband oder Parafilm.
      HINWEIS: Harnstoffkristalle bleiben monatelang bei Raumtemperatur stabil.
   2. Stellen Sie sich die Harnstoffkristalle vor.
      1. Legen Sie die Harnstoffschale auf den Mikroskoptisch und konzentrieren Sie sich auf einen Harnstoffkristall.
      2. Stellen Sie die Wellenlänge des Anregungslasers auf 900 nm ein.
      3. Verwenden Sie einen Emissionsfilter, der 450 nm Wellenlängen erfasst.
      4. Erhalten Sie ein Fluoreszenz-Lebensdauerbild des Harnstoffkristalls mit Laserleistung an der Probe <1 mW und verwenden Sie die in Schritt 2.2.4 genannten empfohlenen Bildgebungsparameter.
   3. Stellen Sie sich die gelb-grünen (YG) Perlen als Fluoreszenzlebensdauerstandard vor.
      1. Erstellen Sie eine YG-Perlenfolie, indem Sie die YG-Perlenlösung 1:1.000 in sterilem Wasser verdünnen. Legen Sie ein kleines Volumen (~ 30 μL) auf einen Objektträger oder eine Glasbodenschüssel. Mit einem Deckglas abdecken und die Ränder des Deckglases mit klarem Nagellack versiegeln.
      2. Platzieren Sie den YG-Perlenträger auf dem Mikroskoptisch mit der Deckglasseite des Objektträgers in Richtung Objektiv.
      3. Stellen Sie die Wellenlänge des Anregungslasers auf 890 nm ein
      4. Verwenden Sie einen Emissionsfilter, der Wellenlängen von ~ 500-600 nm erfasst.
      5. Erhalten Sie ein Fluoreszenz-Lebensdauerbild der YG-Perle mit einer Laserleistung an der Probe <1 mW und den empfohlenen Bildparametern [Schritt 2.2.4].
      6. Überprüfen Sie die Lebensdauer der Perle mit dem IRF des Harnstoffs. Wenn die Lebensdauer nicht ~ 2,1 ns beträgt, überprüfen Sie, ob die Perle mit einer anderen Perle in Kontakt kommt, die zur Fluoreszenzlöschung beiträgt, die Perlenlösung getrocknet ist, die Perle unscharf ist, IRF nicht genau ist oder die Verschiebung zwischen IRF und Fluoreszenzzerfall nicht optimiert ist [siehe Schritt 4.2.4].
         HINWEIS: Die Lebensdauer von ~ 2,1 ns ist im Laufe der Zeit stabil.
4. NAD(P)H-Bildgebung
   1. Legen Sie die Glasbodenschale mit den Zellen auf den Mikroskoptisch und konzentrieren Sie sich auf die Zellen.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, die Zellen in einer Umgebungskammer zu platzieren, um den Wärme-, Feuchtigkeits- und _CO2-Gehalt während der Bildaufnahme aufrechtzuerhalten, da diese Parameter den Zellstoffwechsel beeinflussen können.
   2. Stellen Sie die Verstärkung des Detektors auf den optimalen Wert für FLIM ein. Ändern Sie außerdem die gewünschte Verweilzeit - ein Parameter, der die Zeit angibt, die der Laser an jedem Pixel der Probe verbringt.
      HINWEIS: Diese Parameter sollten während des restlichen Vorgangs gleich bleiben. Dies soll die Konsistenz der Laserbeleuchtung und der Detektoreinstellungen sicherstellen, um die Gültigkeit der intensitätsbasierten Messungen sicherzustellen, die von Laserleistung, Scanparametern und Detektorverstärkung abhängen. Es gibt eine optimierte Detektorverstärkung für den Betrieb von Detektoren im Einzelphotonenzählmodus; Der Wert beträgt 85 % für das System, auf das verwiesen wird.
   3. Stellen Sie den Multiphotonenlaser auf 750 nm ein. Stellen Sie sicher, dass die Leistungsregelung für den Laser zunächst auf Null eingestellt ist, damit die Zellen beim Öffnen des Verschlusses am Laser nicht beschädigt werden.
      HINWEIS: Für NAD(P)H wird eine Anregung bei 750 nm empfohlen, obwohl sie bei 700-750 nm eine breite Absorption aufweist. Eine Anregung bei 890 nm wird für FAD empfohlen, obwohl sie bei 700-900 nm eine breite Absorption aufweist.
   4. Stellen Sie einen Emissionsfilter ein oder wählen Sie ihn aus, um Emissionswellenlängen bei ~ 400-500 nm zu erfassen.
   5. Beginnen Sie mit der Fokussierung oder Live-Ansicht, um die Bildeinstellungen zu optimieren.
      HINWEIS: Der Laser ist jetzt in Betrieb. Öffnen Sie das Mikroskopgehäuse an dieser Stelle nicht. Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung.
   6. Erhöhen Sie die Laserleistung langsam auf ~ 3-8 mW an der Probe und stellen Sie gleichzeitig sicher, dass die Zellen im Fokus sind. Zeichnen Sie nach der Anpassung die maximal verbrauchte Leistung auf. Verwenden Sie diese Energieeinstellung für die Bildgebung auf anderen Segmenten der Petrischale für die NAD(P)H-Bildgebung.
      HINWEIS: Es ist wichtig, die Laserleistung an der Probe oder einem Pick-off-Fenster zu messen und sich nicht auf die Spannung der Pockels-Zelle zu verlassen, da die Pockels-Zellen nicht stabil sind. Oft wird die Laserleistung während der Bildgebung mit einem Pick-off-Fenster statt an der Probe überwacht. Mit einem zweiten Leistungsmesser am Objektiv kann das Verhältnis zwischen der Leistung am Pick-off-Fenster und der Leistung an der Probe verwendet werden, um die ungefähre Leistung an der Probe aus den Pick-off-Fenstermessungen zu schätzen.
   7. Sammeln Sie ein NAD(P)H FLIM-Bild mit einer Bildintegrationszeit von 60 s.
   8. Überprüfen Sie, ob das Bild genügend Photonen (Peak von ~ 100 Photonen für ein Zytoplasmapixel) innerhalb der Fluoreszenzlebensdauer-Zerfallskurve aufweist. Wenn die Anzahl der Photonen zu gering ist, erhöhen Sie die Laserleistung oder die Dauer der Bildaufnahme.
      HINWEIS: Die minimale Spitzenanzahl von Photonen innerhalb des exponentiellen Fluoreszenzzerfalls hängt von Systemparametern ab, einschließlich zeitlicher Auflösung, IRF und Hintergrundrauschen.
5. FAD-Bildgebung
   1. Stellen Sie den Multiphotonenlaser auf 890 nm ein und warten Sie, bis er bei der neuen Wellenlänge im Modus gesperrt ist. Stellen Sie sicher, dass die Leistungsregelung für den Laser zunächst auf Null eingestellt ist, damit die Zellen beim Öffnen des Verschlusses am Laser nicht beschädigt werden.
      HINWEIS: Verschieben Sie die Stufe oder den objektiven Fokus nicht, wenn Sie diesen Schritt ausführen. Das FAD-Sichtfeld (FOV) sollte für dieses Bild direkt mit NAD(P)H FOV übereinstimmen.
   2. Stellen Sie einen Emissionsfilter ein oder wählen Sie ihn aus, um Emissionswellenlängen bei ~500-600 nm zu erfassen.
   3. Beginnen Sie mit der Fokussierung oder Live-Ansicht, um die Bildeinstellungen zu optimieren.
      HINWEIS: Der Laser ist jetzt in Betrieb. Öffnen Sie das Mikroskopgehäuse an dieser Stelle nicht.
   4. Erhöhen Sie die Laserleistung an der Probe langsam auf ~5-10 mW und zeichnen Sie die maximal verbrauchte Leistung auf. Verwenden Sie dies als Energieeinstellung für die Bildgebung auf anderen Segmenten der Petrischale für die FAD-Bildgebung.
   5. Sammeln Sie ein FAD FLIM-Bild mit einer Bildintegrationszeit von 60 s.
   6. Überprüfen Sie, ob das Bild genügend Photonen (Peak von ~ 100 Photonen für ein Zytoplasmapixel) innerhalb der Fluoreszenzlebensdauer-Zerfallskurve aufweist. Wenn die Anzahl der Photonen zu gering ist, erhöhen Sie die Laserleistung oder die Dauer der Bildaufnahme.
      HINWEIS: Die minimale Spitzenanzahl von Photonen innerhalb des exponentiellen Fluoreszenzzerfalls hängt von Systemparametern ab, einschließlich zeitlicher Auflösung, IRF und Hintergrundrauschen.
6. Wiederholen Sie die Schritte 2.4-2.5 an weiteren vier bis fünf FOVs. Stellen Sie sicher, dass jedes Bild mindestens 2 FOVs von den abgebildeten Positionen entfernt ist.

3. Vorbereitung des Cyanid-Experiments

1. Lösen Sie 130,24 mg Natriumcyanid in 25 ml PBS auf, um eine 80 mM (20x) Natriumcyanidlösung herzustellen.
   HINWEIS: Cyanid ist giftig. Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung.
2. Aspirieren Sie 100 μL Kulturmedium aus der Schale. Ersetzen Sie dies durch 100 μL Natriumcyanidlösung, um eine Konzentration von 4 mM Cyanid in der Schale zu erhalten.
3. Legen Sie die Zellen für 5 Minuten in einen Inkubator, damit die Zellen mit der Cyanidlösung reagieren können.
4. Wiederholen Sie die Schritte 2.4-2.6, um NAD(P)H- und FAD-Bilder der Zellen nach der Cyanid-Exposition aufzunehmen.
   HINWEIS: Längere Exposition gegenüber Zyanid tötet die Zellen ab. Postcyanid-Bilder werden innerhalb von 30 Minuten nach der Cyanid-Zugabe aufgenommen.

4. FLIM-Bildanalyse

1. Öffnen Sie die FLIM-Lebensdaueranalysesoftware.
   1. Öffnen Sie das Harnstoffbild, um den gemessenen IRF zu erfassen.
   2. Importieren Sie das Harnstoffbild. Wählen Sie einen Punkt auf dem Bild des Harnstoffkristalls aus, der für die Bildanalyse verwendet werden soll. Erhöhen Sie den räumlichen Bin-Wert , um FLIM-Daten von mehreren Pixeln auf 1 oder höher für einen Zerfallspeak > 100 Photonen zu integrieren, indem Sie die Bin-Variable auf der Hauptoberfläche der Software ändern.
   3. Speichern Sie die Daten als IRF.
      1. Klicken Sie in der referenzierten Software auf das Dropdown-Menü mit dem Titel IRF und wählen Sie Aus Abklingdaten kopieren aus. Klicken Sie anschließend auf In Zwischenablage kopieren , um bei der Bildanalyse des während des Experiments aufgenommenen Bildes verwendet zu werden.
2. Bildanalyse von NAD(P)H- und FAD-Lebensdauerbildern
   1. Importieren Sie die Bilddatei in eine Fluoreszenz-Lebensdaueranalyse-Software.
   2. Verbessern Sie die Bildvisualisierung, um die Zellen und subzellulären Kompartimente zu sehen, indem Sie bei Bedarf die Intensität und den Kontrast ändern.
      1. Klicken Sie auf das Dropdown-Menü Optionen und wählen Sie Intensität aus. Ändern Sie hier die Intensität und den Kontrast nach Belieben und klicken Sie auf Ok.
   3. Importieren Sie den IRF aus dem Harnstoffbild.
      1. Klicken Sie auf das Dropdown-Menü IRF und wählen Sie Aus Zwischenablage einfügen aus.
   4. Legen Sie multiexponentielle Zerfallsparameter50 fest.
      1. Legen Sie einen Schwellenwert fest, um Zerfälle für Zytoplasmapixel auszuwerten.
         HINWEIS: Hier wurde ein Wert von 50 verwendet. Der Wert wurde durch Vergleich der Fluoreszenzspitzenwerte mehrerer repräsentativer Hintergrund- und Kernpixel mit dem Spitzenwert mehrerer Zytoplasmapixel ausgewählt. Für den Schwellenwert wurde ein Wert zwischen den Kernpixeln und den Zytoplasmapixeln ausgewählt.
   5. Überprüfen Sie, ob der Shift-Wert den IRF relativ zum steigenden Rand der Fluoreszenz ausrichtet. Passen Sie die Verschiebung bei Bedarf an einen Wert an, der den Chi-Quadrat-Wert minimiert.
   6. Erhöhen Sie den räumlichen Behälter, sodass Zytoplasmapixel Fluoreszenzspitzenwerte bei oder über 100 aufweisen.
      HINWEIS: Das Erhöhen des räumlichen Behälters führt zu einer verringerten räumlichen Auflösung.
   7. Berechnen Sie die Fluoreszenzlebensdauer für alle Pixel im Bild.
      1. Klicken Sie im referenzierten Programm auf das Dropdown-Menü Berechnen | Zerfallsmatrix.
         HINWEIS: Der Erfolg wird mit einem Bild angezeigt, das auf die amplitudengewichtete Fluoreszenzlebensdauer falsch gefärbt ist.
   8. Speichern Sie die Daten zur Fluoreszenzlebensdauer.
      1. Klicken Sie auf das Dropdown-Menü Datei | Ausfuhr. Wählen Sie die gewünschten Parameter für die Analyse aus und klicken Sie auf OK. Speichern Sie das Bild.
      2. Wählen Sie die Schaltfläche Farbe aus dem Dropdown-Menü Optionen, um die angezeigte Fluoreszenzlebensdauermetrik und die Farbkonfiguration auf B-G-R anzupassen und die spezifischen Mindest- und Höchstwerte für Farbbalken festzulegen, um die Farbskala des Fluoreszenzlebensdauerbildes anzupassen.

Abbildung 2: Gemessener IRF von Harnstoffkristall. (A) Intensitätsbild aus dem Harnstoff. Ein repräsentatives Pixel wurde ausgewählt, um die IRF-Zerfallskurve (B) für die anschließende Analyse von Fluoreszenzlebensdauerbildern von Zellen zu erstellen. Abkürzung: IRF = Instrument Response Function. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

3. Zellsegmentierung
   HINWEIS: Das hier beschriebene Protokoll verwendet eine ^{Bildanalysesoftware51}. Repräsentative MCF-7-Bilder und Datenanalysecode werden ^{bereitgestellt52.}
   1. Laden Sie die Datei MCF7_Segmentation_Final.cpproj52 herunter.
   2. Importieren Sie die MCF7_Segmentation Pipeline, indem Sie auf Datei | klicken | importieren Pipeline aus Datei, wählen Sie die Datei MCF7_Segmentation_Final.cpproj aus.
   3. Klicken Sie auf das Modul Bilder und fügen Sie die zu segmentierenden NAD(P)H-Intensitätsbilder hinzu.
      HINWEIS: Bilder müssen im .tif-, .png- oder .jpg-Format vorliegen.
   4. Klicken Sie unten links auf die Schaltfläche Bilder analysieren .
      HINWEIS: Die Pipeline muss möglicherweise für Bilder optimiert werden, die auf verschiedenen Systemen erfasst wurden. Führen Sie zur Problembehandlung die folgenden Unterschritte aus
      1. Verwenden Sie den Testmodus , um verschiedene Parameter zu testen: Klicken Sie auf Testmodus starten und führen Sie jedes Modul aus, indem Sie auf die Wiedergabeschaltfläche neben dem Modulnamen klicken.
      2. Klicken Sie auf das erste IdentifyPrimaryObjects-Modul , und passen Sie den typischen Durchmesser von Objekten in Pixeleinheiten (Min, Max) an den Durchmesser der Zellen an.
         HINWEIS: Für MCF-7-Zellen wurden 10 bzw. 40 Pixel für das Minimum bzw. Maximum verwendet.
      3. Klicken Sie auf das Modul EnhanceOrSuppressFeatures , und passen Sie die KE-Größe an, um die Identifizierung des ausgewählten KE-Typs zu verbessern.
         HINWEIS: Für MCF-7-Zellen wurde eine Funktionsgröße von 10 Pixeln verwendet.
      4. Klicken Sie auf das zweite Modul EnhanceOrSuppressFeatures , und passen Sie den Bereich der Bohrungsgrößen an, um die Verbesserung der Kernbereiche zu optimieren.
         HINWEIS: Für MCF-7-Zellen wurde ein Bereich von 5-20 verwendet.
      5. Klicken Sie auf das zweite Modul IdentifyPrimaryObjects , und passen Sie die Parameter (Schwellenwertstrategie, Schwellenwertmethode, Schwellenwertglättungsskala und Schwellenwertkorrekturfaktor) an, um die Identifizierung von Kernen zu optimieren. Klicken Sie auf ? von jedem Parameter, um optimale Einstellungen zu identifizieren und auf das Modul IdentifySecondaryObjects anzuwenden.
      6. Klicken Sie auf das Modul FilterObjects und passen Sie die Flächenform an. Wählen Sie ein minimales und maximales Pixel der zu identifizierenden Flächenform aus.
         HINWEIS: Für die MCF-7-Zellen wurden 100 und 500 für das Maximum bzw. Minimum verwendet. Der Prozess der Zellsegmentierung durch Identifizierung des Zellkerns und die Ausbreitung auf die Zellgrenzen wird von Walsh und ^Skala47 ausführlich erläutert.
   5. Verwenden Sie die Zellzytoplasmamasken, um die Fluoreszenzlebensdauer-Ausgangsvariablen für jede Zelle im Bild zu mitteln.

Abbildung 3: Identifizierung und Segmentierung einzelner Zellen. Das NAD(P)H-Intensitätsbild von MCF7-Zellen (A), das durch die Integration eines Fluoreszenzlebensdauerbildes erhalten wurde. Die Zellen wurden mit einer Anregung von 750 nm bei 5 mW für 60 s abgebildet. Die x- und y-Achsen stellen die Pixelposition des Bildes dar. (A) Einzelne Zellen wurden identifiziert. Die Zellen wurden maskiert (B), um Hintergrundgeräusche aus dem Datensatz zu entfernen. Der Zellkern wurde dann identifiziert (C) und auf die Zellmaske (D) projiziert. Die Zellen wurden dann gefiltert (E), um maskierte Bereiche zu entfernen, die nicht zur Größe typischer Zellen passen. Maßstabsleiste = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

5. Alternative Methode: Fluoreszenzintensitätsbildgebung

1. Schalten Sie die Geräte ein, die während des Experiments verwendet werden.
   HINWEIS: Fluoreszenzintensitätsbilder können mit Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopen, konfokalen Fluoreszenzmikroskopen oder Multiphotonenmikroskopen aufgenommen werden.
   1. Stellen Sie sicher, dass das zu verwendende Mikroskop über eine geeignete Anregungsquelle für NAD(P)H (Einzelphotonenwellenlänge ~370-405 nm: Zwei-Photonen-Wellenlänge ~700-750 nm) und FAD (Einzelphotonenwellenlänge ~488 nm, Zwei-Photonen-Wellenlänge ~890 nm) verfügt.
   2. Stellen Sie sicher, dass das Mikroskop über einen Filter zur Isolierung der NAD(P)H-Emission (~400-500 nm) verfügt.
      HINWEIS: 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) Einstellungen funktionieren oft für NAD(P)H.
   3. Stellen Sie sicher, dass das Mikroskop über einen Filter zur Isolierung der FAD-Emission (~ 500-600 nm) verfügt.
      HINWEIS: Die Einstellungen für grün fluoreszierendes Protein (GFP) funktionieren häufig für FAD.
2. Bereiten Sie das Mikroskop vor.
   1. Schalten Sie die Hellfeldlampe ein. Stellen Sie sicher, dass Licht in das Okular gelangt. Tragen Sie bei Bedarf 1 Tropfen des entsprechenden Tauchmediums auf das entsprechende Objektiv auf.
   2. Bewegen Sie das Objektiv nach unten, um die Proben ohne Interferenzen richtig zu platzieren. Stellen Sie die Petrischale richtig auf die Bühne. Stellen Sie sicher, dass die Probe sicher ist und sich während der Bildgebung nicht bewegt.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, die Zellen in einer Umgebungskammer zu platzieren, um den Wärme-, Feuchtigkeits- und _CO2-Gehalt während der Bildaufnahme aufrechtzuerhalten, da diese Parameter den Zellstoffwechsel beeinflussen können.
   3. Zentriere die Probe mit dem Objektiv. Sobald dies erledigt ist, schauen Sie in das Okular und bewegen Sie das Objektiv, bis die Zellen im Fokus zu sein scheinen.
3. Beginnen Sie mit der Intensitätsbildgebung.
   1. Öffnen Sie die Bildgebungssoftware und stellen Sie die Anregungs- und Emissionskonfiguration so ein, dass NAD(P)H erfasst wird, indem Sie in der Bildaufnahmesoftware auf die Registerkarte Erfassung klicken und den NAD(P)H-Anregungs- und Emissionsfilter im Mikroskoprevolver positionieren.
      HINWEIS: Für die NAD(P)H-Bildgebung wurden ein 357/44-Anregungsfilter, ein dichroitischer 409-Langpass- und ein 447/60-Emissionsfilter verwendet.
   2. Optimieren Sie die Anregungsbeleuchtung und die Detektorparameter. Wenn das Bleichen ein Problem darstellt, reduzieren Sie die Beleuchtungsintensität und erhöhen Sie die Bildintegrationszeit.
      HINWEIS: NAD(P)H ist ein schwaches Signal; Achten Sie auf das Bleichen, wenn zu viel Strom verbraucht wird.
   3. Erfassen Sie ein NAD(P)H-Bild der gewünschten Bildgröße. Stellen Sie sicher, dass das Bild gespeichert ist.
   4. Stellen Sie die Anregungs- und Emissionskonfiguration ein, um FAD zu erfassen. Optimieren Sie die Anregungsbeleuchtung und die Detektorparameter.
      HINWEIS: Für die FAD-Bildgebung wurden ein 458/64-Anregungsfilter, ein 495-Longpass-dichroitischer und ein 550/88-Emissionsfilter verwendet.
   5. Erwerben Sie ein FAD-Bild. Stellen Sie sicher, dass das Bild gespeichert ist.
      HINWEIS: NAD(P)H- und FAD-Bilderfassungsparameter (Beleuchtungsintensität, Bildgröße, Detektorverstärkung) sollten während des gesamten Bildgebungsexperiments gleich bleiben.
   6. Wiederholen Sie den Vorgang an weiteren fünf Standorten, die mindestens 2 FOVs von den abgebildeten Positionen entfernt sind.
4. Redox-Ratio-Datenanalyse auf Bildebene
   1. Öffnen Sie die NAD(P)H- und FAD-Intensitätsbilder in einem Bildverarbeitungsprogramm.
   2. Legen Sie einen Schwellenwert für die NAD(P)H fest, um Zytoplasmapixel beizubehalten, und legen Sie Hintergrund- und Kernpixel auf 0 fest.
   3. Berechnen Sie das Redoxverhältnisbild, indem Sie die Gleichung FAD/(NAD(P)H+FAD) an jedem Pixel mit dem geschwellenden NAD(P)H-Bild auswerten.
   4. Berechnen Sie den Mittelwert der Nicht-0-Pixel.
      HINWEIS: Diese Schritte können in Bildanalysesoftware ausgeführt oder direkt mit Skripten codiert werden.
5. Analyse des Redoxverhältnisses auf Zellebene
   1. Führen Sie die Schritte 4.3.1-4.3.5 aus, um ein Maskenbild der Zellen in jedem NAD(P)H-Bild zu erhalten.
   2. Berechnen Sie das Redoxverhältnisbild, indem Sie die Gleichung FAD/(NAD(P)H+FAD) an jedem Pixel auswerten.
   3. Verwenden Sie die Zellzytoplasmamaske, um das Redoxverhältnis für alle Pixel für jede Zelle im Bild zu mitteln.

Ergebnisse

Die epitheliale Brustkrebs-Zelllinie, MCF-7, wurde in DMEM kultiviert, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin. Für die Fluoreszenzbildgebung wurden die Zellen mit einer Dichte von 4 × 105 Zellen pro ³⁵ mm Glasboden-Bildgebungsschale 48 h vor der Bildgebung ausgesät. Die Zellen wurden vor und nach der Cyanidbehandlung unter Verwendung der oben genannten Protokolle abgebildet. Ziel des Cyanidexperiments ist es, die spektrale Isolierung von NAD(P)H- und FAD-Fluoreszenz zu bes...

Diskussion

Die Autofluoreszenzintensität und die lebenslange Bildgebung wurden häufig zur Beurteilung des Stoffwechsels in Zellen ^{eingesetzt21,55}. FLIM ist hochauflösend und löst daher einzelne Zellen auf, was für Krebsstudien wichtig ist, da die zelluläre Heterogenität zur Tumoraggression und Arzneimittelresistenz beiträgt7,39,41,44,45,46,58.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-deoxy-d-glucose (2-DG)	Sigma	AC111980000; AC111980010; AC111980050; AC111980250
Antibiotic Antimicrobial (pen-strep)	Gibco	15240096
Cell Samples	American Type Culture Collection	N/A	MCF-7 cancer line
CellProfiler	Broad Institute	N/A	Image analysis software
Conical Tube	VWR	89039-664	15 mL conical tube
DMEM	ThermoFisher	11965092	Culture media
FAD dichroic mirror	Semrock	FF495-Di03-25x36	495 nm
FAD emission filter	Semrock	FF01-550/88-25	550/88 nm
FAD excitation filter	Semrock	FF01-458/64-25	458/64 nm
FBS	ThermoFisher	16000036
Fluorescence Lifetime Microscope	3i	N/A
Glass bottom dish	MatTek Corp	P35G-1.0-14-C
Multiphoton Laser	Coherent	N/A	2P Coherent Laser, Tunable 680 nm-1080 nm
NAD(P)H dichroic mirror	Semrock	FF409-Di03-25x36	409 nm
NAD(P)H emission filter	Semrock	FF02-447/60-25	447/60 nm
NAD(P)H excitation filter	Semrock	FF01-357/44-25	357/44 nm
PBS	ThermoFisher	70011044
Potassium Cyanide	Sigma-Aldrich	380970
SlideBooks 6	3i	N/A	Image acquisition software
SPCImage	Becker & Hickl GmbH	N/A	Fluorescence lifetime analysis software
Stage Top Incubator	okoLab	N/A
Trypsin	Biosciences	786-262
Urea	Sigma-Aldrich	U5128
YG beads	Polysciences	19096-2	Yg microspheres (20.0 µm)