Imagem de autofluorescência para avaliar o metabolismo celular

Resumo

Este protocolo descreve imagens de fluorescência e análise das aconzyomas metabólicas endógenas, dinucleotídeos de nicotinamida reduzida (fosfato) dinucleotídeos (NAD(P)H) e dinucleotídeo de adenina de flavina oxidada (FAD). A imagem de autofluorescência de NAD(P)H e FAD fornece um método sem rótulos e não destrutivo para avaliar o metabolismo celular.

Resumo

O metabolismo celular é o processo pelo qual as células geram energia, e muitas doenças, incluindo o câncer, são caracterizadas pelo metabolismo anormal. Adenina de nicotinamida reduzida (fosfato) dinucleotídeo (NAD(P)H) e dinucleotídeo de adenina oxidada (FAD) são aconsetos de reações metabólicas. Nad(P)H e FAD exibem autofluorescência e podem ser isolados espectralmente por comprimentos de onda de excitação e emissão. Ambos os aconzymes, NAD(P)H e FAD, podem existir em uma configuração livre ou ligada à proteína, cada uma das quais tem uma fluorescência distinta ao longo da vida - o tempo para o qual o fluorohore permanece no estado animado. A imagem vitalícia da fluorescência (FLIM) permite quantificação da intensidade da fluorescência e das vidas de NAD(P)H e FAD para análise livre de rótulos do metabolismo celular. A intensidade da fluorescência e os microscópios de vida podem ser otimizados para a imagem NAD(P)H e FAD, selecionando os comprimentos de onda de excitação e emissão apropriados. Perturbações metabólicas por cianeto verificam protocolos de imagem de autofluorescência para detectar alterações metabólicas dentro das células. Este artigo demonstrará a técnica de imagem de autofluorescência de NAD(P)H e FAD para medir o metabolismo celular.

Introdução

Metabolismo é o processo celular de produção de energia. O metabolismo celular abrange múltiplas vias, incluindo glicólise, fosforilação oxidativa e glutaminolise. Células saudáveis usam essas vias metabólicas para gerar energia para proliferação e função, como a produção de citocinas por células imunes. Muitas doenças, incluindo distúrbios metabólicos, câncer e neurodegeneração, são caracterizadas pelo metabolismo celular ^alterado1. Por exemplo, alguns tipos de células cancerígenas têm elevadas taxas de glicólise, mesmo na presença de oxigênio, para gerar moléculas para a síntese de ácidos nucleicos, proteínas e lipídios2,3. Este fenômeno, conhecido como efeito Warburg, é uma marca registrada de muitos tipos de câncer, incluindo câncer de mama, câncer de pulmão e glioblastomas4. Devido às alterações do metabolismo celular associadas à progressão do câncer, o metabolismo celular pode ser um biomarcador substituto para a resposta de ^drogas5,6. Além disso, entender a eficácia da droga a nível celular é crucial, pois a heterogeneidade celular pode levar a diferentes respostas medicamentosas em ^{indivíduos7,8}.

Tecnologias que identificam e quantificam mudanças no metabolismo celular são essenciais para estudos de câncer e resposta a medicamentos. Análises químicas e proteicas são usadas para avaliar o metabolismo de células ou tecidos, mas não possuem resolução unicelular e informações espaciais. Ensaios baseados em leitor de placas metabólicas podem medir o consumo de pH e oxigênio na amostra ao longo do tempo e a subsequente perturbação metabólica por produtos químicos. O pH pode ser usado para calcular a taxa de acidificação extracelular (ECAR), que fornece uma visão da atividade glicóltica das ^células9. Os métodos de imagem de todo o corpo, incluindo 2-[fluorine-18] tomografia fluoro-D-glicose e emissão de pósitrons (FDG PET) e espectroscopia de ressonância magnética (MRS), são modalidades de imagem não invasivas utilizadas clinicamente para identificar a recidiva do tumor e a eficácia da droga através de medições metabólicas10,11,12,13,14.

Imagens FDG-PET a absorção tecidual de FDG, um analógico de glicose radiolaterada. O aumento da absorção do FDG-PET por tumores relativos ao tecido circundante deve-se ao efeito ^Warburg12,13. Imagens mrs núcleos comuns de moléculas usadas para o metabolismo, como ^13C e ^31P, e podem obter informações dinâmicas sobre como o metabolismo muda em resposta a estímulos, como exercício ou ^comer14. Embora o FDG-PET e o MRS possam ser utilizados clinicamente, essas tecnologias carecem de resolução espacial para resolver a heterogeneidade intratumoral. Da mesma forma, as medidas de consumo de oxigênio são feitas em uma população em massa de células. A imagem de autofluorescência supera o obstáculo de resolução espacial dessas tecnologias e fornece um método não invasivo de quantificar o metabolismo celular.

Figura 1: NADH e FAD em vias metabólicas comuns. NADH e FAD são aconchegantes usados na glicólise, no ciclo de Krebs e na cadeia de transporte de elétrons. A imagem de autofluorescência dessas moléculas fornece informações sobre o metabolismo celular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Adenina de nicotinamida reduzida (fosfato) dinucleotídeo (NAD(P)H) e dinucleotídeo de alcaina oxidada (FAD) são aconzyomas de reações metabólicas, incluindo glicólise, fosforilação oxidativa e glutaminolise (Figura 1). Tanto o NAD(P)H quanto o FAD são autofluorescentes e fornecem contraste endógeno para imagens de fluorescência1,15. O NADPH tem propriedades fluorescentes similares ao NADH. Por causa disso, o NAD(P)H é frequentemente usado para representar o sinal combinado de NADH e NADPH2,16.

A imagem de fluorescência ao longo da vida (FLIM) quantifica a vida útil da fluorescência ou o tempo para o qual um fluoróforo está no estado animado. As vidas de fluorescência são responsivas ao microambiente dos fluoroforos e fornecem informações sobre o metabolismo ^celular17. Nad(P)H e FAD podem existir dentro das células em conformações ligadas à proteína ou livres, cada uma das quais tem uma vida útil diferente. O NAD(P)H gratuito tem uma vida útil mais curta do que o NAD(P)H vinculado à proteína); por outro lado, a FAD livre tem uma vida útil mais longa do que o ^FAD18,19 vinculado. As vidas e os pesos dos componentes ao longo da vida podem ser quantificados a partir de dados de decaimento vitalício de fluorescência através de Eq. (1)²⁰:

I(t) = α ^1e-t/_τ1 + α _2e-t^/_τ2 + C (1)

Eq (1) representa a intensidade de fluorescência normalizada em função do tempo. Os α ₁ e α ₂ nesta equação representam os componentes proporcionais de vida curta e longa (α ₁+ α ₂=1), respectivamente, _τ1 e _τ2 representam as vidas curtas e longas, respectivamente, e C é responsável pela luz de ^fundo7,20. A vida útil ponderada por amplitude, representada aqui como _τm, é calculada utilizando-se de Eq. (2).

τm= α _1τ1+ α _2τ2 (2)

Uma vida média pode ser calculada pela média "t" sobre a decadência de intensidade do fluoróforo, que para uma decadência bi-exponencial é mostrado por Eq. (3)^17,21.

τ*_m= (α _1τ12+ α _2τ22)/ (α _1τ1+ α _2τ2) (3)

Uma imagem de intensidade de fluorescência pode ser computada a partir da imagem vitalícia integrando a decadência da fluorescência ao longo da vida. A imagem de autofluorescência é um método não destrutivo e livre de rótulos que pode ser usado para caracterizar o metabolismo das células vivas em uma resolução subcelular. A razão óptica redox fornece uma métrica analógica óptica do estado químico redox da célula e é calculada como a razão das intensidades NAD(P)H e FAD. Embora a fórmula para calcular a razão óptica redox não seja padronizada22,23,24,25, ela é definida aqui como a intensidade da FAD sobre as intensidades combinadas de NAD(P)H e FAD. Esta definição é usada porque a intensidade somada no denominador normaliza a métrica entre 0 e 1, e o resultado esperado da inibição de cianeto é uma diminuição na razão redox. As vidas de fluorescência do NAD(P)H e FAD gratuitos fornecem insights sobre mudanças no microambiente metabólico solvente, incluindo pH, temperatura, proximidade com oxigênio e ^{osmolaridade17}.

Alterações na vida de fluorescência das frações vinculadas de NAD(P)H e FAD podem indicar a utilização da via metabólica e o metabolismo específico do ^substrato26. Os pesos dos componentes podem ser interpretados para alterações na fração livre para a fração vinculada dos ^{aconchegantes18,19}. Ao todo, essas métricas quantitativas de vida de autofluorescência permitem a análise do metabolismo celular, e a imagem de autofluorescência tem sido utilizada para identificar neoplasias de tecidos ^normais27,28, caracterizando células-tronco29,30, avaliando a função das células imunes31,32,33,34,35, aferosa atividade ^{neurológica36, 37,38}, e entendendo a eficácia de medicamentos em tipos de câncer, como câncer de mama e câncer de cabeça e ^{pescoço21,39,40,41,42}. A imagem de autofluorescência de alta resolução pode ser combinada com segmentação de imagem para análise unicelular e quantificação da heterogeneidade intrapopulação43,44,45,46,47.

Os microscópios NAD(P)H e FAD podem ser imagens em microscópios de fluorescência de fofilas ou multifotofon configurados para intensidade ou imagens vitalícias. Para microscópios de fótons únicos, NAD(P)H e FAD são tipicamente animados em comprimentos de onda de 375-405 nm e 488 nm, respectivamente, devido a fontes de laser comuns nesses comprimentos de ^onda48. Na excitação da fluorescência de dois fótons, NAD(P)H e FAD irão excitar em comprimentos de onda de aproximadamente 700 a 750 nm e 700 a 900 nm, ^{respectivamente15,49}. Uma vez que os fluoroforos estão animados, NAD(P)H e FAD emitem fótons em comprimentos de onda entre ~410 nm a ~490 nm e ~510 nm a ~640 nm, ^{respectivamente15}. Os comprimentos de onda de emissão NAD(P)H e FAD maxima são de aproximadamente 450 nm e 535 nm, ^{respectivamente48}.

Devido à sua excitação e comprimentos de onda de emissão diferentes, a fluorescência das duas coenzimas metabólicas pode ser isolada espectralmente. É necessário compreender as características espectrais de NAD(P)H e FAD) para o projeto e otimização dos protocolos de imagem de autofluorescência. Cianeto é um inibidor complexo IV da cadeia de transporte de elétrons (ETC). Os efeitos do cianeto no metabolismo celular e nas intensidades de autofluorescência e vida útil de NAD(P)H e FAD dentro das células são bem ^{caracterizados27,40}. Portanto, um experimento de perturbação de cianeto é um meio eficaz de validar protocolos de imagem NAD(P)H e FAD. Um experimento de cianeto bem sucedido fornece confiança de que o protocolo de imagem NAD(P)H e FAD pode ser usado para avaliar o metabolismo de grupos desconhecidos ou perturbações.

Protocolo

1. Revestimento de células para imagem

1. Aspire o meio a partir de um frasco T-75 confluente de 80-90% de células MCF-7, enxágue as células com 10 mL de soro fisiológico estéril tamponado (PBS) e adicione 2 mL de 0,25% de trippsina (1x) para desprender as células do fundo do frasco.
2. Incubar o frasco a 37 °C por ~4 min. Verifique as células sob o microscópio para confirmar o desprendimento.
3. Adicione imediatamente 8 mL de meio de cultura para desativar a trippsina.
4. Coletar as células em um tubo cônico (15 mL ou 50 mL). Conte as células usando um hemócito.
5. Centrifugar as células 200 × g por 5 min.
6. Uma vez centrifuso, aspire o supernatante. Resuspenque a pelota de células em 1 mL de meio de cultura, e a semente 4 × ¹⁰⁵ células em uma antena de imagem de fundo de vidro de 35 mm (ou o suporte de amostra apropriado para o microscópio que está sendo usado).
7. Adicione 2 mL de cultura média ao prato de imagem para manter o metabolismo celular.
8. Incubar as células a 37 °C com 5% de _CO2 por 24-48 h antes da imagem para que as células aderam e atinjam a fase de crescimento logarítmico.
   NOTA: A fase de crescimento foi determinada pela experiência prévia com essas células e confirmada com a folha de dados celular.

2. Imagens de FLIM multifotonas de NAD(P)H e FAD

1. Ligue todos os componentes do microscópio de vida de fluorescência multifotônio, incluindo o microscópio, a fonte de laser e os detectores que estão sendo usados.
2. Colocação da amostra
   1. Ligue a lâmpada de campo brilhante. Certifique-se de que a luz está entrando na ocular. Escolha um objetivo, geralmente 20x, 40x ou 100x para imagens celulares. Aplique 1 gota do meio de imersão apropriado em cima do objetivo [pule se usar um objetivo de ar].
   2. Mova o objetivo para baixo para colocar corretamente a amostra sem tocar no objetivo. Coloque o prato de fundo de vidro sobre o suporte de amostra no estágio do microscópio. Certifique-se de que a amostra está segura e não se moverá durante a imagem.
   3. Centralizar o espécime com o objetivo usando o controle de estágio X-Y. Uma vez feito isso, olhe para a ocular e mova o objetivo para cima para se concentrar nas células.
   4. Se o microscópio estiver dentro de um gabinete, feche a porta da caixa de luz. Abra o software de aquisição de imagens, clique na guia Multiphoton Imaging e defina os seguintes parâmetros de imagem multifotônio: tamanho da imagem = 256 x 256 pixels; tempo de moradia dos pixels = 4-25 μs; tempo total de aquisição de imagens = ~60 s; ganho de detector otimizado para contagem de fótons únicos = 85% (específico para o sistema que está sendo utilizado).
3. Imagem da Função de Resposta ao Instrumento (IRF) e Padrão de Vida Fluorescente
   1. Coloque cristais de ureia em um prato de fundo de vidro e fixe a tampa do prato com fita ou parafilm.
      NOTA: Os cristais de ureia permanecem estáveis à temperatura ambiente por meses.
   2. Imagem dos cristais de ureia.
      1. Coloque o prato de ureia no palco do microscópio e foque em um cristal de ureia.
      2. Defina o comprimento de onda do laser de excitação para 900 nm.
      3. Use um filtro de emissão que capture comprimentos de onda de 450 nm.
      4. Obtenha uma imagem de fluorescência ao longo da vida do cristal de ureia com potência laser na amostra <1 mW e use os parâmetros de imagem recomendados mencionados na etapa 2.2.4.
   3. Imagem das contas verde-amarela (YG) como um padrão de vida fluorescência.
      1. Crie um slide de contas YG diluindo a solução de contas YG 1:1.000 em água estéril. Coloque um pequeno volume (~30 μL) em um slide ou prato de fundo de vidro. Cubra com uma mancha de cobertura e sele as bordas da tampa com esmalte claro.
      2. Coloque o slide da conta YG no estágio do microscópio com o lado do deslizamento do slide em direção ao objetivo.
      3. Defina o comprimento de onda do laser de excitação para 890 nm
      4. Use um filtro de emissão que capture comprimentos de onda de ~500-600 nm.
      5. Obtenha uma imagem de fluorescência ao longo da conta YG usando uma potência laser na amostra <1 mW e os parâmetros de imagem recomendados [passo 2.2.4].
      6. Verifique a vida útil da conta usando o IRF da ureia. Se a vida útil não é ~2.1 ns, verifique se a conta está em contato com outra conta contribuindo para a saciamento da fluorescência, a solução de contas secou, a conta está fora de foco, o IRF não é preciso, ou a mudança entre IRF e fluorescência não é otimizada [ver passo 4.2.4].
         NOTA: A vida útil de ~2.1 ns é estável ao longo do tempo.
4. Imagem NAD(P)H
   1. Coloque o prato de fundo de vidro com as células no estágio do microscópio e foque nas células.
      NOTA: Recomenda-se que as células sejam colocadas em uma câmara ambiental para manter os níveis de calor, umidade e _CO2 durante a aquisição de imagens, pois esses parâmetros podem influenciar o metabolismo celular.
   2. Ajuste o ganho do detector para o valor ideal para FLIM. Além disso, mude para o tempo de moradia desejado - um parâmetro indicando o tempo que o laser gasta em cada pixel do espécime.
      NOTA: Esses parâmetros devem permanecer os MESMOS durante todo o restante do procedimento. Isto é para garantir a consistência na iluminação a laser e nas configurações do detector para garantir a validade das medições baseadas em intensidade, que dependem da potência do laser, dos parâmetros de varredura e do ganho do detector. Há um ganho de detector otimizado para detectores operacionais no modo de contagem de fótons únicos; o valor é de 85% para o sistema referenciado.
   3. Defina o laser multifotônio para 750 nm. Certifique-se de que o controle de alimentação do laser seja definido em zero inicialmente para que as células não sejam danificadas ao abrir o obturador no laser.
      NOTA: A excitação a 750 nm é recomendada para NAD(P)H), embora tenha ampla absorção em 700-750 nm. A excitação a 890 nm é recomendada para FAD, embora tenha ampla absorção em 700-900 nm.
   4. Defina ou selecione um filtro de emissão para coletar comprimentos de onda de emissão em ~400-500 nm.
   5. Comece a imagem de forma focalizada ou ao vivo para otimizar as configurações de imagem.
      NOTA: O laser está funcionando agora. Não abra o gabinete do microscópio neste momento. Use equipamentos de proteção individual adequados.
   6. Aumente lentamente a potência do laser para ~ 3-8 mW na amostra, ao mesmo tempo em que garante que as células estejam em foco. Uma vez ajustado, regise a potência máxima utilizada. Use esta configuração de energia para a imagem em outros segmentos da placa de Petri para imagens NAD(P)H.
      NOTA: É importante medir a potência do laser na amostra ou uma janela de pick-off e não depender da tensão celular dos pockels, pois as células pockels não estão estáveis. Muitas vezes a energia do laser é monitorada durante a imagem com uma janela de pick-off em vez de na amostra. Usando um segundo medidor de potência no objetivo, a relação entre a potência na janela de retirada e a energia na amostra pode ser usada para estimar a potência aproximada na amostra a partir das medições da janela de pick-off.
   7. Colete uma imagem NAD(P)H FLIM com um tempo de integração de imagem de 60 s.
   8. Verifique se a imagem tem fótons suficientes (pico de ~100 fótons para um pixel de citoplasma) dentro da curva de decadência de vida fluorescência. Se o número de fótons for muito baixo, aumente a potência do laser ou a duração da aquisição de imagens.
      NOTA: O número mínimo de pico de fótons dentro da decadência exponencial da fluorescência depende dos parâmetros do sistema, incluindo resolução temporal, IRF e ruído de fundo.
5. Imagem FAD
   1. Ajuste o laser multifotônio para 890 nm e espere que ele bloqueie o modo no novo comprimento de onda. Certifique-se de que o controle de alimentação do laser seja definido em zero inicialmente para que as células não sejam danificadas ao abrir o obturador no laser.
      NOTA: Não mova o estágio ou o foco objetivo ao conduzir esta etapa. O campo de visão FAD (FOV) deve corresponder diretamente ao NAD(P)H FOV para esta imagem.
   2. Defina ou selecione um filtro de emissão para coletar comprimentos de onda de emissão em ~500-600 nm.
   3. Comece a imagem de forma focalizada ou ao vivo para otimizar as configurações de imagem.
      NOTA: O laser está funcionando agora. Não abra o gabinete do microscópio neste momento.
   4. Aumente lentamente a potência do laser para ~5-10 mW na amostra e regise a potência máxima utilizada. Use isso como a configuração de energia para a imagem em outros segmentos da placa de Petri para imagens FAD.
   5. Colete uma imagem FAD FLIM com um tempo de integração de imagem de 60 s.
   6. Verifique se a imagem tem fótons suficientes (pico de ~100 fótons para um pixel de citoplasma) dentro da curva de decadência de vida fluorescência. Se o número de fótons for muito baixo, aumente a potência do laser ou a duração da aquisição de imagens.
      NOTA: O número mínimo de pico de fótons dentro da decadência exponencial da fluorescência depende dos parâmetros do sistema, incluindo resolução temporal, IRF e ruído de fundo.
6. Repetir passos 2.4-2.5 em um adicional de quatro a cinco FOVs. Certifique-se de que cada imagem esteja espaçada a pelo menos 2 FOVs de distância dos locais de imagem.

3. Preparação do experimento de cianeto

1. Dissolva 130,24 mg de cianeto de sódio em 25 mL de PBS para fazer uma solução de cianeto de sódio de 80 mM (20x).
   NOTA: Cianeto é tóxico. Use equipamentos de proteção individual adequados.
2. Aspirar 100 μL de cultura média do prato. Substitua-o por 100 μL de solução de cianeto de sódio para obter uma concentração de 4 mM de cianeto no prato.
3. Coloque as células em uma incubadora por 5 minutos para permitir que as células reajam com a solução de cianeto.
4. Repita as etapas 2.4-2.6 para adquirir imagens NAD(P)H e FAD das células após a exposição ao cianeto.
   NOTA: A exposição prolongada ao cianeto matará as células. As imagens postcyanide são adquiridas dentro de 30 minutos da adição de cianeto.

4. Análise de imagem FLIM

1. Abra o software de análise vitalícia FLIM.
   1. Abra a imagem da ureia para adquirir o IRF medido.
   2. Importe a imagem da ureia. Selecione um ponto na imagem do cristal de ureia a ser usado para análise de imagem. Aumente o valor da lixeira espacial para integrar dados FLIM de vários pixels para 1 ou mais para um pico de decomposição > 100 fótons alterando a variável Bin localizada na interface principal do software.
   3. Salve os dados como um IRF.
      1. No software referenciado, clique no menu suspenso intitulado IRF, selecione Copiar de Dados de Decadência. Depois disso, clique em Copiar para Área de Transferência para ser utilizado na análise de imagem da imagem tirada durante o experimento.
2. Análise de imagem de imagens de vida NAD(P)H e FAD
   1. Importe o arquivo de imagem em software de análise vitalícia de fluorescência.
   2. Melhore a visualização de imagens para ver as células e compartimentos subcelulares alterando a intensidade e o contraste, se necessário.
      1. Clique no menu suspenso opções e selecione Intensidade. Aqui, altere a intensidade e o contraste conforme desejado e clique em Ok.
   3. Importe o IRF da imagem da ureia.
      1. Clique no menu suspenso do IRF e selecione Colar na Área de Transferência.
   4. Defina parâmetros de decaimento multiexponencial50.
      1. Defina um valor limiar para avaliar decaimentos para pixels de citoplasma.
         NOTA: Aqui, foi utilizado um valor de 50. O valor foi selecionado comparando os valores de pico de fluorescência de vários pixels representativos de fundo e núcleo com o valor máximo de vários pixels citoplasma. Um valor entre os pixels do núcleo e os pixels de citoplasma foi selecionado para o limiar.
   5. Verifique se o valor Shift alinha o IRF em relação à borda crescente da fluorescência. Ajuste a mudança se necessário para um valor que minimize o valor quadrado de Chi.
   6. Aumente a caixa espacial para que os pixels de citoplasma tenham valores de pico de fluorescência em ou acima de 100.
      NOTA: O aumento da lixeira espacial levará à diminuição da resolução espacial.
   7. Compute vida de fluorescência para todos os pixels da imagem.
      1. No programa referenciado, clique no menu Calcular de retirada | Matriz de decadência.
         NOTA: O sucesso é indicado com uma imagem de cor falsa para a vida de fluorescência ponderada por amplitude.
   8. Guarde os dados de vida da fluorescência.
      1. Clique no menu suspenso do arquivo | Exportar. Escolha os parâmetros desejados para análise e clique em Ok. Salve a imagem.
      2. Selecione o botão Color no menu suspenso opções para ajustar a métrica de vida da fluorescência exibida, a configuração de cor para B-G-R e defina os valores mínimos e máximos da barra de cores específicas para ajustar a escala de cor da imagem de vida da fluorescência.

Figura 2: IRF medido de cristal de ureia. (A) Imagem de intensidade obtida da ureia. Um pixel representativo foi escolhido para criar a curva de decaimento IRF (B) para análise subsequente de imagens de vida fluorescência das células. Abreviação: IRF = função de resposta ao instrumento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Segmentação celular
   NOTA: O protocolo descrito aqui usa um software de análise de ^imagem51. São fornecidas imagens representativas do MCF-7 e código de análise de ^dados52.
   1. Baixe o arquivo MCF7_Segmentation_Final.cpproj52.
   2. Importe o MCF7_Segmentation Pipeline clicando em Arquivo | | de importação Pipeline a partir de arquivo, selecione o arquivo MCF7_Segmentation_Final.cpproj.
   3. Clique no módulo Imagens e adicione as imagens de intensidade NAD(P)H a serem segmentadas.
      NOTA: As imagens devem estar em .tif, .png ou .jpg formato.
   4. Pressione analisar o botão Imagens no canto inferior esquerdo.
      NOTA: O pipeline pode precisar de otimização para imagens adquiridas em diferentes sistemas. Para solucionar problemas, experimente os seguintes subpassos
      1. Use o Modo de Teste para testar diferentes parâmetros: Clique no Modo de Teste iniciar e execute cada módulo clicando no botão de reprodução ao lado do nome do módulo.
      2. Clique no primeiro módulo IdentificarObjects privativos e ajuste o diâmetro típico dos objetos, em unidades de pixels (Min, Max) para combinar com o diâmetro das células.
         NOTA: Para as células MCF-7, foram utilizados 10 e 40 pixels para o mínimo e máximo, respectivamente.
      3. Clique no módulo EnhanceOrSuppressFeatures e ajuste o tamanho do recurso para melhorar a identificação do tipo de recurso selecionado.
         NOTA: Um tamanho de recurso de 10 pixels foi usado para células MCF-7.
      4. Clique no segundo módulo EnhanceOrSuppressFeatures e ajuste a gama de tamanhos de furos para otimizar o aprimoramento das regiões nucleares.
         NOTA: Foi utilizada uma faixa de 5-20 para células MCF-7.
      5. Clique no segundo módulo IdentifyPrimaryObjects e ajuste os parâmetros (Estratégia limiar, método de limiarização, escala de suavização de limiar e fator de correção de limiar) para otimizar a identificação de núcleos. Clique no ? por cada parâmetro para identificar as configurações ideais e aplicar no módulo IdentificarSecondaryObjects .
      6. Clique no módulo FilterObjects e ajuste a forma da área. Selecione um pixel mínimo e máximo da forma de área a ser identificada.
         NOTA: Para as células MCF-7, foram utilizadas 100 e 500 para o máximo e o mínimo, respectivamente. O processo de segmentação celular identificando o núcleo e a propagação para os limites celulares é explicado em detalhes por Walsh e ^Skala47.
   5. Usando as máscaras de citoplasma celular, uma média das variáveis de saída de vida da fluorescência para cada célula dentro da imagem.

Figura 3: Identificação e segmentação de células individuais. A imagem de intensidade NAD(P)H das células MCF7 (A) obtida pela integração de uma imagem de vida fluorescência. As células foram imagens usando excitação de 750 nm a 5 mW para 60 s. Os eixos x e y representam a localização do pixel da imagem. a Células individuais foram identificadas. As células foram mascaradas (B) para eliminar qualquer ruído de fundo do conjunto de dados. O núcleo foi então identificado (C) e projetado na máscara celular (D). As células foram então filtradas (E) para remover áreas mascaradas que não se encaixam no tamanho das células típicas. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Método alternativo: Imagem de intensidade de fluorescência

1. Ligue o equipamento que será usado durante o experimento.
   NOTA: Imagens de intensidade de fluorescência podem ser adquiridas com microscópios de fluorescência de campo largo, microscópios de fluorescência confocal ou microscópios multifotônios.
   1. Certifique-se de que o microscópio a ser usado tenha uma fonte de excitação apropriada para NAD(P)H (comprimento de onda de fóton único ~370-405 nm: comprimento de onda de dois fótons ~700-750 nm) e FAD (comprimento de onda de fóton único ~488 nm, comprimento de onda de dois fótons ~890 nm).
   2. Certifique-se de que o microscópio tenha um filtro para o isolamento da emissão de NAD(P)H (~400-500 nm).
      NOTA: 4',6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) configurações muitas vezes funcionam para NAD(P)H.
   3. Certifique-se de que o microscópio tenha um filtro para isolamento da emissão de FAD (~500-600 nm).
      NOTA: As configurações de proteína fluorescente verde (GFP) geralmente funcionam para a FAD.
2. Prepare o microscópio.
   1. Ligue a lâmpada de campo brilhante. Certifique-se de que a luz está entrando na ocular. Aplique 1 gota do meio de imersão apropriado em cima do objetivo correspondente, se necessário.
   2. Mova o objetivo para baixo para colocar corretamente as amostras sem qualquer interferência. Coloque a placa de Petri no palco corretamente. Certifique-se de que a amostra está segura e não se moverá durante a imagem.
      NOTA: Recomenda-se que as células sejam colocadas em uma câmara ambiental para manter os níveis de calor, umidade e _CO2 durante a aquisição de imagens, pois esses parâmetros podem influenciar o metabolismo celular.
   3. Centralizar o espécime com o objetivo. Uma vez feito isso, olhe para a ocular e mova o objetivo até que as células pareçam estar em foco.
3. Comece a imagem de intensidade.
   1. Abra o software de imagem e defina a configuração de excitação e emissão para capturar NAD(P)H clicando na guia Capture no software de aquisição de imagens e posicionando o filtro de excitação e emissão NAD(P)H na torre do microscópio."
      NOTA: Um filtro de excitação 357/44, 409 filtros de emissão de longopass foram utilizados para imagem NAD(P)H).
   2. Otimize os parâmetros de iluminação de excitação e detector. Se o branqueamento for um problema, reduza a intensidade de iluminação e aumente o tempo de integração da imagem.
      NOTA: NAD(P)H é um sinal fraco; estar ciente do branqueamento se muito poder for usado.
   3. Adquira uma imagem NAD(P)H do tamanho da imagem desejada. Certifique-se de que a imagem está salva.
   4. Defina a configuração de excitação e emissão para capturar FAD. Otimize os parâmetros de iluminação de excitação e detector.
      NOTA: Um filtro de excitação 458/64, 495 filtro de emissão de longopass foram utilizados para a imagem FAD.
   5. Adquira uma imagem FAD. Certifique-se de que a imagem está salva.
      NOTA: Os parâmetros de aquisição de imagens NAD(P)H e FAD (intensidade de iluminação, tamanho da imagem, ganho de detector) devem permanecer os mesmos durante todo o experimento de imagem.
   6. Repita o processo em mais cinco locais, espaçado pelo menos 2 FOVs longe dos locais imagens.
4. Análise de dados da razão redox em nível de imagem
   1. Abra as imagens de intensidade NAD(P)H e FAD em um programa de processamento de imagens.
   2. Defina um limiar no NAD(P)H para reter pixels de citoplasma e definir pixels de fundo e núcleo para 0.
   3. Calcule a imagem da razão redox avaliando a equação FAD/(NAD(P)H+FAD) em cada pixel usando a imagem NAD(P)H limiar.
   4. Calcule o valor médio dos não-0 pixels.
      NOTA: Essas etapas podem ser executadas em software de análise de imagens ou codificadas diretamente com scripts.
5. Análise da razão redox do nível celular
   1. Siga as etapas 4.3.1-4.3.5 para obter uma imagem de máscara das células dentro de cada imagem NAD(P)H).
   2. Calcule a imagem da razão redox avaliando a equação FAD/(NAD(P)H+FAD) em cada pixel.
   3. Usando a máscara de citoplasma celular, é média a razão redox para todos os pixels para cada célula dentro da imagem.

Resultados

A linha de células cancerígenas de mama epitelial, MCF-7, foi cultivada em DMEM suplementada com 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% penicilina-estreptomicina. Para a imagem de fluorescência, as células foram semeadas a uma densidade de 4 × ¹⁰⁵ células por 35 mm de imagem de fundo de vidro 48 h antes da imagem. As células foram imagens antes e depois do tratamento com cianeto usando os protocolos acima indicados. O objetivo do experimento cianeto é confirmar o isolamento espectral da fluorescência NAD...

Discussão

A intensidade da autofluorescência e a imagem vitalícia têm sido amplamente utilizadas para avaliar o metabolismo nas ^{células21,55}. FLIM é de alta resolução e, portanto, resolve células únicas, o que é importante para estudos de câncer, pois a heterogeneidade celular contribui para a agressão tumoral e resistência a medicamentos7,39,41,44,45,46,58.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-deoxy-d-glucose (2-DG)	Sigma	AC111980000; AC111980010; AC111980050; AC111980250
Antibiotic Antimicrobial (pen-strep)	Gibco	15240096
Cell Samples	American Type Culture Collection	N/A	MCF-7 cancer line
CellProfiler	Broad Institute	N/A	Image analysis software
Conical Tube	VWR	89039-664	15 mL conical tube
DMEM	ThermoFisher	11965092	Culture media
FAD dichroic mirror	Semrock	FF495-Di03-25x36	495 nm
FAD emission filter	Semrock	FF01-550/88-25	550/88 nm
FAD excitation filter	Semrock	FF01-458/64-25	458/64 nm
FBS	ThermoFisher	16000036
Fluorescence Lifetime Microscope	3i	N/A
Glass bottom dish	MatTek Corp	P35G-1.0-14-C
Multiphoton Laser	Coherent	N/A	2P Coherent Laser, Tunable 680 nm-1080 nm
NAD(P)H dichroic mirror	Semrock	FF409-Di03-25x36	409 nm
NAD(P)H emission filter	Semrock	FF02-447/60-25	447/60 nm
NAD(P)H excitation filter	Semrock	FF01-357/44-25	357/44 nm
PBS	ThermoFisher	70011044
Potassium Cyanide	Sigma-Aldrich	380970
SlideBooks 6	3i	N/A	Image acquisition software
SPCImage	Becker & Hickl GmbH	N/A	Fluorescence lifetime analysis software
Stage Top Incubator	okoLab	N/A
Trypsin	Biosciences	786-262
Urea	Sigma-Aldrich	U5128
YG beads	Polysciences	19096-2	Yg microspheres (20.0 µm)