医薬品評価研究のための3D腫瘍スフェロイドの作製

要約

この記事では、3次元腫瘍スフェロイドを構築するための標準化された方法を示します。また、自動イメージングシステムを用いたスフェロイド観察と画像ベースの深層学習解析の戦略についても説明します。

要約

ここ数十年で、単層培養細胞に加えて、抗がん剤を評価するための潜在的に強力なツールとして、3次元腫瘍スフェロイドが開発されてきました。しかし、従来の培養方法では、腫瘍スフェロイドを三次元レベルで均質に操作する能力が欠けていました。この制限に対処するために、本論文では、平均的なサイズの腫瘍スフェロイドを構築するための便利で効果的な方法を提示します。さらに、プレート全体をスキャンして3次元回転楕円体のデータを取得できる人工知能ベースの解析ソフトウェアを使用した画像ベースの解析方法についても説明します。いくつかのパラメータが研究された。腫瘍スフェロイド構築の標準的な方法とハイスループットイメージングおよび解析システムを使用することにより、3次元スフェロイドで実行される薬物検査の有効性と精度を劇的に向上させることができます。

概要

癌は、特に死亡率が高いため、人間が最も恐れている病気の1^{つです1。}近年、新しい治療法が導入されるにつれて、癌を治療する可能性が高まっています^2,3,4,5。2次元(2D)および3次元(3D)in vitroモデルは、実験室環境で癌を研究するために使用されます。ただし、2Dモデルは、抗腫瘍感受性を示すすべての重要なパラメーターを即座に正確に評価することはできません。したがって、それらは薬物^{療法試験における}in vivo相互作用を完全に表すことができない6。

2020年以降、世界の3次元(3D)培養市場は大幅に拡大しています。NASDAQ OMXのあるレポートによると、3D細胞培養市場の世界的な価値は2025年末までに27億米ドルを超えるでしょう。2D培養法と比較して、3D細胞培養は増殖と分化だけでなく、長期生存のためにも最適化できる有利な特性を示します^7,8。このような手段により、in vivo細胞の微小環境をシミュレートして、より正確な腫瘍の特性評価と代謝プロファイリングを取得できるため、ゲノムおよびタンパク質の変化をよりよく理解できます。このため、3Dテストシステムは、特に新規抗腫瘍薬のスクリーニングと評価に焦点を当てた主流の医薬品開発業務に含める必要があります。スフェロイド構造における不死化樹立細胞株または初代細胞培養物の三次元増殖は、低酸素症や薬物浸透などの腫瘍のin vivoの特徴、ならびに細胞相互作用、応答、耐性を有しており、in vitro薬物スクリーニングを行うための厳格で代表的なモデルと見なすことができます9,10,11。

ただし、これらの3D培養モデルには、解決に時間がかかる可能性のあるいくつかの問題もあります。細胞スフェロイドはこれらのプロトコルを用いて形成することができるが、培養時間や包埋ゲル¹²などの特定の詳細が異なるため、これらの構築された細胞スフェロイドは、限られたサイズ範囲では十分に制御できない。スフェロイドのサイズは、生存率試験と画像解析の一貫性に影響を与える可能性があります。増殖微小環境および成長因子も様々であり、細胞¹³間の分化の違いにより異なる形態をもたらし得る。現在、制御されたサイズですべてのタイプの腫瘍を構築するための標準的で単純で費用効果の高い方法が明らかに必要とされています。

別の観点からは、形態、生存率、および増殖速度を評価するために均質アッセイおよびハイコンテントイメージングアプローチが開発されてきたが、3Dモデルのハイスループットスクリーニングは、腫瘍スフェロイドの位置、サイズ、および形態の均一性の欠如など、文献で報告されているさまざまな理由により依然として課題である¹⁴、^15、16。

ここで紹介するプロトコルでは、3D腫瘍スフェロイドの構築における各ステップをリストし、オートフォーカス、オートイメージング、および分析などの有利な特性を含むハイスループット、ハイコンテントイメージングシステムを使用したスフェロイド観察および分析の方法について説明します。この方法では、ハイスループットイメージングに適した均一なサイズの3D腫瘍スフェロイドをどのように生成できるかを示します。これらのスフェロイドは、抗がん剤治療に対しても高い感受性を示し、スフェロイドの形態学的変化は、ハイコンテントイメージングを使用して監視できます。要約すると、薬物評価目的で3D腫瘍構築物を生成する手段として、この方法論の堅牢性を実証します。

プロトコル

1.回転楕円体構造

1. 培養プレートの付着防止処理
   1. 癒着防止試薬100 μLをU字型ウェル底部を有する48ウェルプレートの各ウェルにピペットで入れ、10分間保持する。10分後、コーティング試薬を吸引し、滅菌PBSで2回洗浄した。
   2. 培養プレートを使用時までインキュベーター(5%_CO2で加湿空気中37°C)に入れる。
2. 細胞の調製、収集、および計数
   1. 細胞に特異的な培養液を使用して、細胞培養フラスコ内で細胞を培養する(補足表2)。例えば、NCI-H23、CT-26細胞はRPMI 1640で培養され、HT-29細胞はマッコイの5A培地で培養されます。これら2つの培地には、それぞれ10%の熱不活化FBSと1%のP / Sが補充されています。
   2. 増殖中は、すべての細胞を標準培養条件(5%_CO2を含む加湿空気中で37°C)に維持します。ここでは、NCI-H23細胞株を以下の工程で一例として用いる。
   3. T25フラスコで培養した細胞を1x PBSで2回洗浄して培養液を除去します(対数期の細胞を選択し、80%〜90%のコンフルエントで細胞を継代することをお勧めします)。
   4. 増殖した細胞を1 mLの0.25%トリプシン/EDTAで、37°C、5%_CO2のインキュベーターで1〜2分間処理します。顕微鏡で細胞の形状(この場合は通常円形)を確認し、トリプシン処理を中止します。これを行うには、T25フラスコで使用済みのトリプシン/EDTA懸濁液を吸引し、4 mLの新しい培地で細胞を洗浄します。
   5. すべての懸濁液(5 mL)を15 mLチューブに移します。1 mLの新鮮な培地を使用して残留細胞を洗い流し、チューブに追加します。細胞を186.48 x g で室温で5分間遠心分離します。
   6. 上清を除去し、10 mLの新鮮な培地を細胞ペレットに加え、細胞が均一な懸濁液になるまで穏やかにピペッティングします。
   7. 0.1 mLの細胞懸濁液を新しい遠沈管に吸引し、0.9 mLの新しい培地を加えてから、懸濁液をピペットでよくピペットで移します。
   8. 細胞計数のために10 μLの細胞懸濁液を抽出します。このプロセスを2〜3回実行し、平均値を取ります。
   9. ステップ1.2.7の細胞計数プロセスから得られた濃度に従って、懸濁液を希釈して最終播種密度50,000 cells/mLに到達させます。
3. 細胞培養とスフェロイド形成
   1. 200 μLの細胞懸濁液を48ウェルU底プレートの各ウェルに加えます。
   2. シーリングフィルムをプレートに巻き付け、119.35 x g で室温で5分間遠心分離します。
   3. プレートを遠心分離機から慎重に取り出し、保護フィルムを引き剥がします。次に、5〜8 mLの滅菌水をウェルを囲む水路に追加し(蒸発を防ぐため)、37°Cで5日間インキュベートします。期間中は、水路に水を交換/補充しないでください。
   4. 次の5日間に細胞凝集を観察します。
      注:一般に、細胞は5日以内にコロニーとして凝集し始めます。しかしながら、スフェロイド構築のプロセスは、異なる細胞タイプおよび細胞密度により、より速くまたは遅くなり得る。このため、細胞は3つの可能な方法のうちの1つを使用して毎日観察されなければなりません。まず、細胞をウェルプレートの底部を通して観察することができる。細胞がまだ回転楕円体を形成していない場合、細胞の単層が底に見える。細胞が回転楕円体を形成すると、各ウェルのU底に高密度の3D構築物が観察されます。別の方法は、顕微鏡下で細胞をチェックすることを含む。細胞が腫瘍スフェロイドになると、構造には3つの層(増殖層、不活性層、およびスフェロイドの外側から内側への壊死コア)が含まれ、透明度の勾配があります。最後に、培地の色は観察目的にも使用できます。これは、デジタルマイクロスコープを使用しても3層構造がはっきりと見えない場合に役立ちます。培地が紫赤色から黄色に変わると、スフェロイドをゲルに埋め込むプロセスが開始されます。細胞凝集期間中に培地を交換しないでください。
4. ゲル包埋
   注:ゲルは-20°C未満の温度で保存する必要があります。 特に、ゲルは温度変動を避けるために冷蔵庫のドアから遠く離れた場所に配置する必要があります。プロセスのこの段階では、ゲルは凍結状態にあることに注意してください。
   1. -20°Cの冷蔵庫から冷凍ゲルを取り出し、実験中ずっとアイスボックスに置きます。
   2. 細胞スフェロイドを顕微鏡で観察します。ゲルの包埋を開始する前に、スフェロイドの状態をデジタル顕微鏡で再度確認する必要があります。
   3. 150 μLの培地を慎重に除去します。プレートもアイスボックスに置く必要があります。
   4. ウェルの壁側から液体ゲルをゆっくりと加え、予冷したピペットチップをウェルの周りと内側に動かして、各スフェロイドをゲルに埋め込みます。5分間待ってから、ゲルが均等に広がらない場合は、10 μLのピペットチップでゲルを静かにピペットでピペットします。各ウェルには、腫瘍スフェロイド、25 μLの3.5 mg/mLゲル、および50 μLの完全培地が含まれています。75 μLの培地もコントロールに追加します。
      注:各ウェルには1つの回転楕円体が含まれています。
   5. ヒドロゲル化が完全に完了するまで、プレートを37°Cで30分間インキュベートします。ゲル化状態を顕微鏡で確認する。
   6. 各サンプルに125 μLの新鮮な培地を重ねます。
   7. スフェロイドをさらに7〜10日間培養します。それぞれ4〜6個のウェルを持つスフェロイドのグループを準備し、分析用に少なくとも3つを選択します。
      注:薬物検査を行う場合は、1つのサンプルに対して2つのグループを準備してください。1つのグループは生存率テストに使用され、もう1つのグループは画像のキャプチャと分析に使用されます。

2.薬物治療

1. 製造元の指示に従って薬を溶かしてください。DMSOで100倍の実用的な溶液を調製します。段階希釈で少なくとも5回分の薬物を調製する。ここでは、肺癌治療薬AMG 510を例に挙げて用いる。組成を 付表1に示す。
2. ポジティブコントロールとして0.1%DMSOを使用します。
3. 125 μLの薬物処理培地を各ウェルに加え、プレートをインキュベーターに戻します(5%_CO2を含む加湿空気中で37°C)。この段階では、各ウェルには腫瘍スフェロイド、25 μLの3.5 mg/mLゲル、および175 μLの培地が含まれています。コントロールには200μLの培地が含まれています。

3.スフェロイドの生存率

1. メーカーのガイドラインに従って、Alamar Blueアッセイキットを使用してスフェロイドの生存率を測定します。アラマーブルー処理を行った後のマイクロプレート光度計(570nmおよび600nmにおける吸光度)を用いて生存率を測定する。
2. スフェロイドをゲルに包埋した後の1日目、4日目、7日目、および10日目の生存率をそれぞれ、または示されているように測定します。
   注:Alamar Blueアッセイを使用する場合、少なくとも16時間の反応時間が必要です。したがって、0日目、3日目、6日目、および9日目の午後に20μLのアラマーブルーを追加します。
3. 各ウェルの上清培地100 μLを新しい試験プレートに吸引し、培養プレートの各ウェルに新鮮な培地80 μLを加えます。次に、さらに100μLの薬物処理培地を交換します。井戸にアラマーブルーの残骸がないことを確認してください。
   注:培地交換は、生存率がテストされるたびに行われ、画像解析グループの薬物処理培地は同じ日に交換する必要があります。

4. 薬物検査における画像によるスフェロイド観察と深層学習解析

1. イメージング
   1. イメージング前に培地100 μLを吸引します。
   2. プレートをステージに置きます。スフェロイドのデジタル画像は、10倍の対物レンズ(最初は2倍の対物レンズ)を備えた自動顕微鏡を使用して取得します。顕微鏡は、これらのスフェロイドを自動的に焦点を合わせ、集中させることができます。
      注:オートフォーカス機能と使用されるアルゴリズムは、Yazdanfarらによって以前に報告されています¹⁷。
   3. 自動イメージングを待ちます。各回転楕円体について4つの画像が取得されます。統合された画像が形成され、ハイコンテントイメージングシステムに接続されたソフトウェアで処理されます。
   4. 「画像パッチプロセス」ボタンをクリックして、ソフトウェアに統合された画像を選択します。
   5. 「U-NETモデル」を選択し、コンバージョン率を入力します(10倍の対物レンズ画像のコンバージョン率は3.966です)。下の画面下部をクリックして、画像処理を開始します。次に、直径、周囲長、粗さのデータをスプレッドシートソフトウェアに保存します。
   6. 超過ペリメーター指数(EPI)を計算します。EPIは、式1で計算された回転楕円体の周囲長(P₀)と等価の周囲長(_{P e})の比率です。画像Jを使用して、焦点面(S)での回転楕円体の面積を測定します。次に、式2を使用して回転楕円体の等価周囲長を計算します。
      EPI = (P _o− P e)/P_e (式 1)
      (式 2)
      注:回転楕円体の周囲長は、開発されたU-NETモデルに基づくディープラーニングアルゴリズムを使用してソフトウェアによって生成されます。
   7. 薬剤を含む100 μLの新鮮な培地を加え、プレートをインキュベーターに戻します(5%_CO2を含む加湿空気中で37°C)。
2. スフェロイド阻害
   1. 式3を使用して腫瘍増殖阻害(TGI)を計算します。相対回転楕円体体積(RTV)は、元の体積(式4)に対する終端体積です。回転楕円体の体積(V)は、回転楕円体の直径の出力に応じて、式5を使用してソフトウェアによって自動的に計算されます。
      TGI = (RTV コントロール− RTV_治療)/RTV_{コントロール} × 100% (式 3)
      RTV = V_端子/V_{オリジナル} (式 4)
      V = 4/3π(d/2)³ (式 5)
      注:TGIは 、in vivo 増殖阻害を参照して得られ、腫瘍重量はRTVに置き換えられます。RTV_{コントロール} は対照群の相対スフェロイド体積、RTV_処理 は薬物試験群の相対スフェロイド体積、V_末端 は最終日のスフェロイドの体積、V_{オリジナル} は培養初日のスフェロイドの体積、 d はスフェロイド直径を表す。

結果

図1A、B は、この研究で腫瘍スフェロイドを構築するために使用されたプロセスを示しています。まず、細胞を48ウェルU底プレートに播種しました。この工程は、2D細胞培養で使用される工程とほぼ同じです。プレートをウェルを囲む水を備えた共通のインキュベーターに保管し、沈着した細胞が自己組織化プロセスでスフェロイドを形成し始めるようにし?...

ディスカッション

微小環境は腫瘍の成長に重要な役割を果たします。それは、細胞外マトリックス、酸素勾配、栄養、および機械的相互作用の提供に影響を与える可能性があり、したがって、遺伝子発現、シグナル経路、および腫瘍細胞の多くの機能に影響を与える^{可能性があります19}、^20、21。多くの場合、2D細胞はそのような効果を生み?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5-10 μL Pipette tips	AXYGEN	T-300
1.5 mL Boil proof microtubes	Axygen	MCT-150-C
100-1000μL Pipette tips	KIRGEN	KG1313
15 mL Centrifuge Tube	Nest	601052
200 μL Pipette tips	AXYGEN	T-200-Y
3D gel	Avatarget	MA02
48-well U bottom Plate	Avatarget	P02-48UWP
50 mL Centrifuge Tube	Nest	602052
Alamar Blue	Thermo	DAL1100
Anti-Adherence Rinsing Solution	STEMCELL	#07010
Certified FBS	BI	04-001-1ACS
Deionized water	aladdin	W433884-500ml
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Gibco	11965-092
DMSO	sigma	D2650-100ML
Excel sofware	Microsoft office
Graphpad prism sofware	GraphPad software
High Content Microscope and SMART system	Avatarget	1-I01
Image J software	National Institutes of Health
Insulin-Transferrin-Selenium-A Supplement (100X)	Gibco	51300-044
Parafilm	Bemis	PM-996
PBS	Solarbio	P1020
Penicillin/streptomycin Sol	Gibco	15140-122
RPMI 1640	Gibco	11875-093
Scientific Fluoroskan Ascent	Thermo	Fluoroskan Ascent
T25 Flask	JET Biofil	TCF012050
Trypsin, 0.25% (1X)	Hyclone	SH30042.01