Генерация 3D-опухолевых сфероидов для исследований по оценке лекарственных средств

Резюме

В данной статье демонстрируется стандартизированный метод построения трехмерных опухолевых сфероидов. Также описана стратегия наблюдения сфероидов и анализа глубокого обучения на основе изображений с использованием автоматизированной системы визуализации.

Аннотация

В последние десятилетия, в дополнение к клеткам, культивируемым монослоями, были разработаны трехмерные опухолевые сфероиды в качестве потенциально мощного инструмента для оценки противоопухолевых препаратов. Тем не менее, традиционные методы культивирования не имеют возможности манипулировать опухолевыми сфероидами гомогенным образом на трехмерном уровне. Чтобы устранить это ограничение, в этой статье мы представляем удобный и эффективный метод построения опухолевых сфероидов среднего размера. Кроме того, мы описываем метод анализа на основе изображений с использованием программного обеспечения для анализа на основе искусственного интеллекта, которое может сканировать всю пластину и получать данные о трехмерных сфероидах. Было изучено несколько параметров. Используя стандартный метод построения опухолевого сфероида и высокопроизводительную систему визуализации и анализа, эффективность и точность тестов на лекарства, выполняемых на трехмерных сфероидах, могут быть значительно увеличены.

Введение

Рак является одним из заболеваний, которых больше всего боятся люди, не в последнюю очередь из-за высокого уровня смертности¹. В последние годы возможности лечения рака увеличились, поскольку были введены новые методы лечения 2,3,4,5. Двумерные (2D) и трехмерные (3D) модели in vitro используются для изучения рака в лабораторных условиях. Однако 2D-модели не могут сразу и точно оценить все важные параметры, указывающие на противоопухолевую чувствительность; следовательно, они не могут полностью представить

протокол

1. Конструкция сфероида

1. Антиадгезионная обработка культуральной пластины
   1. Пипетку 100 мкл антиадгезионного реагента в каждую лунку 48-луночной пластины с U-образным дном колодца и держать в течение 10 мин. Через 10 минут аспирируйте реагент для покрытия и дважды промойте стерилизованным PBS.
   2. Поместите культуральную тарелку в инкубатор (37 ° C в увлажненном воздухе с 5% CO₂) до использования.
2. Подготовка, сбор и подсчет клеток
   1. Используйте питательную среду, специфичную для клеток, для культивирования клеток в колбах для клеточных культур (дополнительная таблица 2). Напри....

Результаты

На рисунке 1A, B показан процесс, используемый для построения опухолевых сфероидов в этом исследовании. Сначала мы засеяли клетки в 48-луночную U-образную нижнюю пластину. Этот шаг почти такой же, как и в 2D-культуре клеток. Мы держали пластину в общем инкубаторе с во.......

Обсуждение

Микроокружение играет важную роль в росте опухоли. Он может влиять на обеспечение внеклеточных матриц, градиенты кислорода, питание и механическое взаимодействие и, таким образом, влиять на экспрессию генов, сигнальные пути и многие функции опухолевых клеток 19,20,21.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5-10 μL Pipette tips	AXYGEN	T-300
1.5 mL Boil proof microtubes	Axygen	MCT-150-C
100-1000μL Pipette tips	KIRGEN	KG1313
15 mL Centrifuge Tube	Nest	601052
200 μL Pipette tips	AXYGEN	T-200-Y
3D gel	Avatarget	MA02
48-well U bottom Plate	Avatarget	P02-48UWP
50 mL Centrifuge Tube	Nest	602052
Alamar Blue	Thermo	DAL1100
Anti-Adherence Rinsing Solution	STEMCELL	#07010
Certified FBS	BI	04-001-1ACS
Deionized water	aladdin	W433884-500ml
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Gibco	11965-092
DMSO	sigma	D2650-100ML
Excel sofware	Microsoft office
Graphpad prism sofware	GraphPad software
High Content Microscope and SMART system	Avatarget	1-I01
Image J software	National Institutes of Health
Insulin-Transferrin-Selenium-A Supplement (100X)	Gibco	51300-044
Parafilm	Bemis	PM-996
PBS	Solarbio	P1020
Penicillin/streptomycin Sol	Gibco	15140-122
RPMI 1640	Gibco	11875-093
Scientific Fluoroskan Ascent	Thermo	Fluoroskan Ascent
T25 Flask	JET Biofil	TCF012050
Trypsin, 0.25% (1X)	Hyclone	SH30042.01